外源no供体对花楸树胚胎萌发和幼苗生长的影响

外源no供体对花楸树胚胎萌发和幼苗生长的影响

又名花楸树，又名花木、山槐、山槐、臭檀木和木兰。这是蔷薇科和苹果科。（杨庭辉，2011；2012）。花楸树具有较强的耐性,可在冷(云)杉林中弱光下的腐殖土中萌发,同时它具有很高的观赏价值和木材使用价值。花楸树春季满树银花,夏季羽叶秀丽,秋冬季红果满枝,冬季果实可宿存(Yangetal.,2011)。在一些含有长寿命树种的稠密树林中,花楸树的遗传多样性可能受到威胁。花楸树为生长在小分裂群体中的伴生树种,对高强度的种间竞争比较敏感。该树种的更新能力较弱,最终可能局部消失(郑健等,2007;许建伟等,2010)。因此,需要采取有效措施以保存花楸树的种质资源。目前关于花楸树繁殖研究的报道以有性繁殖为主,组织培养(杨玲等,2010;Yang等,2012)、扦插(苏喜廷等,2005)、嫁接(刘玮等,2006)方面的研究较少。生产实践中多以播种育苗的方式繁殖花楸树苗木。花楸树种子的深休眠特性增加了其播种育苗的难度(沈海龙等,2006;杨玲等,2008a)。花楸树种子经过2~5℃低温层积105天(低温密封贮藏的种子)至120天(新采收成熟种子)才能萌发(杨玲等,2008a)。在2~5℃低温层积过程中,花楸树种皮内ABA含量显著降低,种皮和胚胎内各种生长促进物质的相对含量显著增加(杨玲等,2008b)。将花楸树种子用200mg·L-16-BA溶液浸泡2天后在25℃和5℃变温条件下萌发,可缩短种子萌发起始时间,提高种子发芽率和发芽势(杨玲等,2009)。关于NO调节种子休眠打破和萌发的研究已有报道(Bethkeetal.,2004;Gibaetal.,2007;Gniazdowskaetal.,2007)。人们认为NO可能是由亚硝酸盐和硝酸盐分解产生的(Renataetal.,2006)。已有报道证明外源含氮化合物处理可以代替植物生长调节剂促进种子萌发和幼苗生长。如大麦(Hordeumvulgare)谷粒、拟南芥(Arabidopsisthaliana)种子和一些树木种子经过外源含氮化合物处理后,种子生活力和萌发率均可得到提高(Belignietal.,2000;Bethkeetal.,2004;Gniazdowskaetal.,2010)。更多关于NO功能的研究来自NO供体、NO抑制剂和特殊的抑制物的药理学研究。最常用到的NO供体是硝普钠(SNP)。SNP可以促进许多植物种子萌发(Gniazdowskaetal.,2010)。SNP对光下吸胀的种子萌发的促进效应可以被NO抑制剂(PTIO或cPTIO)解除(Bethkeetal.,2004)。Gniazdowska等(2007)认为NO打破休眠与乙烯合成的增强相关,即NO作为一种调控因子通过调节乙烯生物合成解除苹果(Malusdomestica)胚休眠。进一步的研究表明:NO和氢氰酸(HCN)对休眠的苹果胚萌发的促进效应与胚中和萌发各个阶段中H2O2和超氧阴离子含量的增加相关(Gniazdowskaetal.,2010)。推测活性氧和NO在种子萌发中与传统的植物激素一起作为第二信使起作用(Gniazdowskaetal.,2010)。本文以我国东北地区野生花楸树成熟合子胚胎为材料,利用室内培养皿发芽法研究外源NO供体(SNP)、NO合成抑制剂(PTIO)、脱落酸(ABA)以及乙烯受体抑制剂(NBD)对花楸树胚胎萌发和幼苗发育初期活性氧(ROS)积累的影响。研究结果为了解NO在花楸树种子休眠解除和幼苗初期发育过程中的调控作用及其与植物内源激素的关系奠定基础,为生产中改进花楸树播种育苗方法、提高苗木产量提供理论依据。1材料和方法1.1调查鉴定植物试验材料于2011年9月下旬采自黑龙江省山河屯林业局凤凰山林场,选取1株生长良好的野生成年母树采集成熟果实,采回后调制出种子。种子调制方法同沈海龙等(2006)。1.2方法1.2.1种子吸胀剂试验前选取籽粒饱满、质地均匀的休眠种子(平均千粒质量为1.95g,平均含水量为8.39%,平均生活力为99.0%),在20℃±5℃下的蒸馏水中吸胀48h。将吸胀后的种子用0.2%(V/V)NaClO溶液搅拌浸泡10~15min后用清水冲洗干净。在冰上剥除种皮,用裸胚进行试验。1.2.2no-胚胎发芽效果测试1体外工作过程,把snp预处理的罪犯纳入实验,把其萌发后的不同发育条件下,所有罪犯通过不同培养条件确定生存率的标准,按照保证参照Gniazdowska等(2010)的方法。在500mL烧杯中放置一张用5mL0.05mol·L-1Hepes-KOH(pH值7.0)充分浸湿的滤纸,上面放90个剥离的胚胎。然后在同一烧杯里面再放置一个内含5mL5mmol·L-1SNP溶液(现用现配)的小烧杯,最后用保鲜膜将500mL烧杯的口封好。气态NO可以直接从SNP溶液中释放出来。胚胎暴露在25℃、光下(光照强度为60μmol·m-2s-1)SNP溶液的蒸汽中3h。处理后,用蒸馏水冲洗胚胎并放置在被蒸馏水浸湿的滤纸上。对照为不经过SNP预处理的裸胚。对照和预处理的胚胎在直径9cm的培养皿中(每皿30个胚)在培养室内的光照条件下萌发。萌发培养条件同前述预处理过程。对照和处理均设置3个重复。2snp预处理胚胎在5mmol·L-1SNP溶液的蒸汽中处理(预处理过程同上)3h后,在被3mL300μmol·L-1PTIO溶液浸湿的滤纸上吸胀。对照胚胎为不经过SNP预处理,直接在含有3mL300μmol·L-1PTIO溶液的滤纸上吸胀。萌发培养条件同上。对照和处理均设置3个重复。3aba浓度对催化酶活性的影响胚胎在5mmol·L-1SNP溶液的蒸汽中处理(预处理过程同上)3h后,在含有3mL不同浓度ABA(0.1,0.3,1.0,3.0μmol·L-1)溶液浸湿的滤纸上吸胀。对照胚胎为不经过SNP预处理,直接在含有上述不同浓度ABA溶液的滤纸上吸胀。萌发培养条件同上。对照和处理均设置3个重复。4体外吸剂预处理胚胎在5mmol·L-1SNP溶液的蒸汽中处理(预处理过程同上)3h后,在含有3mL1mmol·L-1NBD溶液浸湿的滤纸上吸胀。对照胚胎为不经过SNP预处理,直接在含有3mL1mmol·L-1NBD溶液的滤纸上吸胀。萌发培养条件同上。对照和处理均设置3个重复。5胚胎萌发起始时间每天观察并记录。以2片子叶均变绿、胚轴和胚根均伸长为种子正常萌发的标志。统计不同处理后的胚胎萌发起始时间;萌发试验第1,2,3,4,5,6,7,8天…,直到萌发结束时的每天的发芽率和各处理的最终发芽率。1.2.3体外受精孵化培养试验1:胚胎在5mmol·L-1SNP溶液的蒸汽中处理(预处理过程同上)3,27,51,75h后,在含有3mL蒸馏水的滤纸上吸胀。对照胚胎为不经过SNP预处理,直接在含有3mL蒸馏水的滤纸上吸胀。萌发培养方法和条件同上。对照和处理均设置3个重复。试验2:胚胎在5mmol·L-1SNP溶液的蒸汽中处理(预处理过程同上)3h后,在含有3mL300μmol·L-1PTIO溶液浸湿的滤纸上吸胀。对照胚胎为不经过SNP预处理,直接在含有3mL300μmol·L-1PTIO溶液的滤纸上吸胀。萌发培养方法和条件同上。对照和处理均设置3个重复。分别在试验1和试验2的第8天时取萌发形成的幼苗进行生理分析。将发芽测定结束后各处理胚胎萌发形成的叶片与初生根分别剪开,分成上部叶片(不接触发芽床的子叶萌发形成的叶片)、下部叶片(接触发芽床的子叶萌发形成的叶片)和根(初生根)3部份。然后各部分等量分成3份并称量,用于下列指标的测定。1鲜质量材料总吸光度测定将约0.05g的叶片用2∶1体积比的丙酮乙醇混合液在25℃下暗中浸提8h,然后用3层滤纸过滤,测652nm下滤液的吸光值。结果用每g鲜质量材料在652nm下的吸光度值表示。用U表示一个OD值,叶绿素含量以U·g-1mL-1作单位。2含量测定称取约0.05g的叶片用2mL0.1%(W/V)冷TCA在冰上匀浆。浸提液在4℃下15000g离心15min。取上清液0.5mL,加入0.5mL10mmol·L-1磷酸钾缓冲液(pH值7.0),在390nm下测定吸收值。H2O2含量用每g鲜质量材料在390nm下的吸光度值表示。用U表示一个OD值,H2O2含量以U·g-1mL-1作单位。3标准曲线的制作提取材料分别为胚胎萌发后形成的上部叶片、下部叶片和初生根。提取方法同上。将1.5mL上清液在1mL1mmol·L-1盐酸羟胺(配制在50mmol·L-1磷酸钾缓冲液中,pH值7.8)溶液中、25℃暗中孵化30min。取混合液0.5mL,连同0.5mL17mmol·L-1磺胺,0.5mL7mmol·L-1甲萘胺溶液一起在25℃暗中孵化30min。将混合液在14000g离心10min后,在540nm下测定吸光值。用NaNO2溶液制作标准曲线。利用标准曲线方程,将OD值转换成NO2-1浓度,用U表示一个NO2-1值,超氧阴离子含量以U·g-1mL-1为单位。1.2.4数据处理方法采用Excel2003软件进行数据处理和绘图,采用DPS(唐启义等,2002)数据处理系统进行方差分析、Duncan多重比较和相关性分析。百分数在统计分析前进行反正弦转换。图表中数据均为3次重复平均值,“±”之后为标准差。2结果与分析2.1no限制胚胎发芽2.1.1no对花楸树胚胎萌发的影响SNP预处理对花楸树胚胎萌发的影响如图1所示,各处理对胚胎萌发影响的差异达到显著水平(P<0.05)。萌发培养的第1天和第2天为子叶张开、子叶扩展和子叶变绿的过程。从第3天开始,部分胚胎的胚轴开始伸长。随着萌发培养时间延长,正常萌发的胚胎比例增加。培养第8天时,SNP+PTIO处理的胚胎萌发率最高为86.67%(与对照的萌发率70.09%差异不显著),其次是PTIO处理(萌发率为75.17%,与对照差异不显著)。而SNP+H2O处理的胚胎萌发率最低(为56.67%,与对照差异不显著)。从图1可知,SNP+PTIO组合处理的胚胎萌发速度较快,在培养的第3天胚胎萌发率即可达到51.11%(约达到最终萌发率的60%),而其他处理的胚胎萌发速度与对照基本一致。SNP+PTIO组合处理的胚胎最终萌发率分别高于SNP或PTIO单独处理的萌发率。说明NO的短期预处理可以影响花楸树的胚胎萌发,过多的外源NO抑制了胚胎的萌发。SNP预处理可以逆转NO清除剂PTIO对胚胎萌发的抑制作用。2.1.2aba对snp培训后胚胎萌发的影响ABA处理对花楸树胚胎萌发的影响见图2。培养第8天时,不同浓度ABA处理对胚胎萌发的影响达到极显著水平(P<0.01)。较高浓度的ABA处理抑制花楸树的胚胎萌发。培养第8天时,3.0μmol·L-1ABA处理的胚胎萌发率最低(为4.00%,与对照差异极显著,P<0.01),其次是1.0μmol·L-1ABA(为34.32%,与对照差异显著,P<0.05)。0.1μmol·L-1ABA和0.3μmol·L-1ABA处理的胚胎萌发率分别为63.47%和86.96%(二者与对照差异不显著,P>0.05)。SNP与不同浓度(0.1,0.3,1.0,3.0μmol·L-1)ABA组合处理对花楸树胚胎萌发的影响见图3。胚胎从第3天开始萌发。培养第8天时,与对照相比,各处理对胚胎萌发的影响差异不显著(P>0.05)。SNP+0.1μmol·L-1ABA处理的胚胎萌发率略高于对照(70.47%),SNP+0.3μmol·L-1ABA,SNP+1.0μmol·L-1ABA,SNP+3.0μmol·L-1ABA处理的胚胎萌发率略低于对照(分别为58.38%,57.89%和46.66%)。比较图2和图3可知,SNP预处理削弱ABA对胚胎萌发的抑制作用。推测SNP预处理可能减小胚胎对ABA的敏感性,从而削弱ABA对胚胎萌发的抑制作用,并且SNP的作用位点可能在ABA作用位点的上游。2.1.3发影响的差异NBD,SNP与NBD组合处理对花楸树胚胎萌发的影响见图4。胚胎从第3天开始萌发。培养第8天时,与对照相比,各处理对胚胎萌发影响的差异不显著(P>0.05)。NBD单独处理、SNP+NBD处理的胚胎萌发率均低于对照(分别为45.46%和42.18%)。由图4可知,NBD处理抑制花楸树胚胎萌发,SNP预处理不能削弱NBD对胚胎萌发的抑制作用。说明花楸树胚胎休眠的解除与乙烯具有密切的相关性。SNP与NBD组合处理不能提高胚胎发芽率,推测是由于SNP的作用位点处于NBD作用位点下游的原因。2.2no对活性氧ros积累的影响2.2.1no限制睡眠时维生素含量1叶片叶绿素含量方差分析结果表明:SNP预处理对胚胎上下部叶片的叶绿素含量和总叶绿素含量的影响均达到极显著水平(P<0.01)。多重比较结果表明:不同SNP处理时间对上下部叶片中叶绿素含量和总叶绿素含量的影响均达到极显著水平(P<0.01)(表1)。相关分析结果表明:上下部叶片中的叶绿素含量呈极显著的正相关关系(r=0.99),但与SNP处理时间的负相关关系不显著(r=-0.26)。各处理中,上下部叶片中叶绿素含量最多的均是SNP处理3h。与对照相比,SNP处理3h的上部叶片中叶绿素含量增加8.88%,下部叶片中的叶绿素含量增加24.51%。这些差异均达到极显著水平(P<0.01)。说明SNP短时间(3h)预处理胚胎可以显著增加幼苗叶片中叶绿素含量。2ptio组合处理前后幼苗叶片叶绿素含量的变化方差分析结果表明:SNP与PTIO组合处理对胚胎上、下部叶片的叶绿素含量和叶绿素总含量的影响均达到极显著水平(P<0.01)。各种处理间的多重比较结果见表2。与SNP单独处理相比,SNP与PTIO组合处理对上部叶片中叶绿素含量影响不显著(P>0.05),但极显著增加下部叶片中的叶绿素含量和总叶绿素含量(与对照的差异也达到极显著水平,P<0.01)。与SNP+PTIO组合处理相比,PTIO单独处理的胚胎萌发后其上部叶片中的叶绿素含量显著增加(21.14%)(P<0.01),但下部叶片中的叶绿素含量则显著减小(约减小35.01%)(P<0.01),二者的总叶绿素含量差异不显著(P>0.05)。说明SNP预处理使幼苗叶片中总叶绿素含量增加的效应不能被NO清除剂PTIO所削弱。NO清除剂PTIO同样可以增加幼苗叶片中总叶绿素含量。推测胚胎萌发形成幼苗后,叶片中叶绿素含量与NO含量相关不密切。2.2.2no限制因素对p22含量的影响1snp处理前后上、下叶片h2含量的相关性方差分析结果表明:SNP预处理对胚胎上部叶片H2O2含量的影响不显著(P>0.05),对下部叶片细胞中的H2O2含量和总H2O2含量的影响均极显著(P<0.01)。多重比较结果见表3。相关分析结果表明:上、下部叶片中的H2O2含量不相关,二者与SNP处理时间的正相关关系不显著(r=0.48)。各处理中,SNP处理75h的上、下部叶片中H2O2含量均为最多。与对照相比,SNP处理75h的上部叶片中H2O2含量增加0.45%,下部叶片中的H2O2含量增加1260.75%。SNP处理75h的上下部叶片中差异达到极显著水平(P<0.01)。说明SNP预处理可以显著引起幼苗叶片中H2O2含量增加。2ptio对上、下叶片中h2含量的影响方差分析结果表明:SNP与PTIO组合处理对胚胎上下部叶片的H2O2含量和总H2O2含量的影响差异不显著(P>0.05)(表4)。与SNP单独处理相比,SNP预处理后的PTIO处理减少上、下部叶片中H2O2含量,总H2O2含量相应减少。与SNP+PTIO组合处理相比,胚胎一直在PTIO中吸胀的处理,使上部叶片细胞中的H2O2含量增加34.04%,但显著减小下部叶片中的H2O2含量(约51.94%),总H2O2含量也被减小。说明SNP预处理引起的幼苗叶片中H2O2含量增加可以被NO清除剂PTIO所减少。2.2.3no限制对超氧阴离子含量的影响1超氧阴离子含量与snp处理时间的关系方差分析结果表明:SNP预处理对胚胎上部叶片超氧阴离子含量的影响不显著(P>0.05),下部叶片及根系中超氧阴离子含量的影响均极显著(P<0.01),对总超氧阴离子含量的影响极显著(P<0.01)。多重比较结果见表5。相关分析结果表明:上、下部叶片、上部叶片与根系中超氧阴离子含量的正相关关系显著(P>0.05),下部叶片与根系中超氧阴离子含量的正相关关系极显著(r=0.94),根系中超氧阴离子含量与SNP处理时间的负相关关系显著(r=-0.84),但上、下部叶片中超氧阴离子含量与SNP处理时间不相关。各处理中,SNP处理3h的上、下部叶片及根系中超氧阴离子含量均为最多。与对照相比,SNP处理3h的上部叶片中超氧阴离子含量增加0.41%,下部叶片中的超氧阴离子含量增加19.57%,根系中超氧阴离子含量减少22.26%。说明SNP短时间预处理可以增加幼苗下部叶片中超氧阴离子含量,随着处理时间延长,则使幼苗各部分构件中的超氧阴离子含量以及总超氧阴离子含量减少。2．ptio对下片超氧阴离子含量的影响方差分析结果表明:SNP与PTIO组合处理对胚胎上、下部叶片及根系的超氧阴离子含量以及超氧阴离子总含量的影响均不显著(P>0.05)(表6)。与SNP单独处理相比,SNP预处理后的PTIO处理增加上部叶片及根系中超氧阴离子含量,但使下部叶片中的超氧阴离子含量减少。与SNP+PTIO组合处理相比,胚胎一直在PTIO中吸胀的处理,使上部叶片细胞中的超氧阴离子含量增加4.01%,下部叶片中的超氧阴离子含量增加21.86%,使根系中的超氧阴离子含量下降34.71%。说明PTIO处理可抑制SNP预处理引起的下部叶片中超氧阴离子含量增加。PTIO对根部超氧阴离子含量的抑制作用可以被SNP预处理削弱。3预处理对花楸树幼苗发育的影响本研究结果表明,SNP短时间预处理可以影响花楸树胚胎萌发。NO清除剂(PTIO)具有抑制胚胎的萌发作用,这种抑制效应可以被SNP预处理逆转。研究结果支持NO能够影响种子休眠解除的结论。NO抑制剂的试验说明NO是一种种子休眠的内源性调节阀。NO能够促进许多植物种子的萌发,特别是光敏感种子的萌发(Gibaetal.,2007)。NO对植物种子萌发的作用具有浓度效应,低浓度的NO对种子萌发有促进作用,高浓度NO则抑制种子萌发(Gibaetal.,2007)。本研究中使用5mmol·L-1SNP预处理3h的试验方法是参考Gniazdowska等(2007)报道的用于苹果胚胎萌发研究所使用的浓度。在培养第8天时统计胚胎萌发率,结果发现SNP+PTIO处理的花楸树胚胎萌发率最高(86.67%,高于对照),而SNP+H2O处理的胚胎萌发率最低(56.67%,低于对照)。说明5mmol·L-1SNP预处理3h对于花楸树裸胚来说处理浓度过高,因此当使用PTIO清除掉多余的NO后,胚胎萌发率得到提高。这提示在今后进一步的研究中应该适当降低SNP处理浓度或是减少SNP处理时间。同时,本研究结果也间接证明了NO对植物种子萌发具有浓度效应的结论。较高的ABA含量是维持花楸树种子休眠的重要调控因子(杨玲等,2008b)。花楸树新采收并调制干燥后的种子中含有较高的ABA含量,在2~5℃低温层积过程中花楸树种皮内ABA含量显著降低(杨玲等,2008b)。本