鼻咽癌细胞中pk3kak和erkmapk信号传导通路异常激活的研究

鼻咽癌细胞中pk3kak和erkmapk信号传导通路异常激活的研究

胰岛素样生长因子-1的受体（igf-1r）与异体igf-1的结合，激活了pi3k-akt和erk-mek两个信号传导通道，在肿瘤细胞的克隆、分化和细胞分化方面发挥着重要作用。本研究采用蛋白印迹技术研究低分化鼻咽癌细胞中IGF-1R及其下游的2个重要分子AKT和ERK的活性表达水平,以及分别给予信号传导通路抑制剂Wortmannin或PD98059后,对鼻咽癌细胞株CNE2中AKT和ERK磷酸化的调节作用,探讨IGF-1R、PI3K/AKT和ERK/MAPK信号传导通路异常激活在鼻咽癌发生、发展过程中的作用。1材料和方法1.1运动组织的冻存武汉大学中南医院耳鼻咽喉科2005-03收治3例鼻咽癌患者,均为男性,年龄分别为45、56和58岁,并经3名资深病理学专家阅片并确诊病理类型为低分化鳞状细胞癌,鼻内窥镜下取癌组织及其周围鼻咽慢性炎症黏膜组织,立即冻存于液氮中。实验时切取液氮保存的鼻咽癌配对标本各100mg,迅速研磨粉碎,然后加300～500μL细胞裂解液(PBS-TDS内加有蛋白酶和磷酸化酶抑制剂)裂解细胞,6000r/min离心10min(R=15cm,4℃),取上清液测蛋白浓度,然后采用蛋白质印迹法测定鼻咽低分化鳞状细胞癌组织和鼻咽慢性炎症黏膜组织中IGF-1R、AKT和ERK1/2蛋白表达水平,β-actin为LoadingControl,实验至少重复4次。1.2材料h0粒体人鼻咽癌细胞株CNE2(来源于人类低分化鼻咽鳞状细胞癌)由瑞典卡罗林斯卡医学院MTC胡立夫教授友好赠送。IGF-1Rβ亚基(H60)粒体为SuntaCruz公司产品。pERK1/2单克隆抗体、pAKT(Ser473)多克隆抗体和选择性抑制ERK/MAPK的抑制剂PD98059均购于CellSignaling公司,IGF-1购自晶美生物工程公司,蛋白激酶抑制剂Wortmannin购自Sigma公司,IMDM培养液为Gibcol公司产品,蛋白质印迹法仪器为美国Bio-Bad公司产品。1.3imda的检测人鼻咽癌细胞株CNE2等量置于6孔盘中,用含10%胎牛血清的IMDM培养液在37℃,体积分数为95%空气或5%的CO2培养箱中进行常规培养。待细胞处于对数生长期时更换无血清的IMDM培养液,继续培养24h后将其分成3组:第1组为未加任何处理组(对照组);第2组为收获细胞前10min仅给予IGF-1;第3组为培养24h后分别给予PD98059(50μmol/L)或Wortmannin(100nmol/L)作用1h,然后收获细胞前10min给予IGF-1(10μg/L)刺激,4℃下立即收获细胞,并提取蛋白。1.4westernblot,wb-brin-al4e,nd-pb-pak/erk蛋白表达上述不同处理组的细胞系分别培养于6孔盘内,收获细胞前用4℃PBS洗3次,然后加300～500μL细胞裂解液(PBS-TDS内加有蛋白酶和磷酸化酶抑制剂)裂解细胞,6000r/min离心10min(R=15cm,4℃),取上清液,BCA法测蛋白浓度,并调整各样本浓度一致。取50μL样本置500μLEP管内并加等量LoadingBuffer,在95℃水浴槽中加热10min,然后蛋白样品进行SDS(7.5%)电泳,并转至硝酸纤维膜上,用一抗稀释液(1∶1000)孵育1h,PBS洗,然后用二抗稀释液(1∶1000)孵育1h,PBS洗,接着用streptavidin-labeledhorseperoxidase稀释液(1∶1000)孵育45min,Hyperfilm-ECL显色5min,压片。磷酸化蛋白pAKT和pERK用抗体Ser-473和抗磷酸化ERK去免疫印迹,总的AKT和ERK蛋白作为LoadingControl。胶片用Fluor-S(BioRad)扫描并用相关软件进行分析。本实验至少重复3次且得到类似结果。1.5elisa法检测细胞生长采用细胞增殖盒kitⅡ(Roche公司产品),四唑氮衍生物可作为线粒体脱氢酶的作用底物,被活细胞还原成水溶性的棕黄色甲簪产物(formazan)。代谢产物在OD450处有吸收峰,以波长492nm在Elisa上检测吸光度,绘出细胞生长曲线,具体实验过程为:细胞置于灭菌加100μL培养液的96孔盘中培养生长良好,然后加不同浓度Wortmannin(0、10、50、100和200nmol/L)或PD98059(0、5、25、50和100μmol/L)培养24和48h,检测前4h每孔加XTT试剂50μL混匀再一起培养,然后在Elisa上读取吸光度值,绘出细胞生长曲线,分析癌细胞生长抑制情况,实验至少重复4次。2结果2.1igf-1r、erk1/2蛋白表达3例鼻咽低分化鳞癌和CNE2细胞株中IGF-1R、AKT和ERK1/2蛋白均呈高信号表达,而鼻咽炎性组织均为低信号表达,CNE2细胞株中IGF-1R、AKT蛋白信号表达较鼻咽低分化鳞癌稍弱,而ERK1/2蛋白表达稍强;在鼻咽低分化鳞癌和CNE2细胞株中,IGF-1R蛋白表达的平均光密度强度分别是鼻咽炎性组织的25和18倍;AKT蛋白表达的平均强度分别是鼻咽组织的25.6和23.4倍;而ERK1/2蛋白表达的平均强度分别是鼻咽组织的34.6和35.5倍(图1)。β-actin作为内对照组。2.2t、akt蛋白表达水平IGF-1可刺激鼻咽癌细胞的pAKT表达增加,与对照组相比,CNE2细胞中pAKT的表达水平明显增高,约为对照组的7倍,而非磷酸化的AKT蛋白表达水平无明显改变。PI3K/AKT信号传导通路的特异性抑制剂Wortmannin(100nmol/L)可大部分下调pAKT蛋白的表达水平,但总的AKT表达水平不受影响(图2)。2.3p-erk抑制剂IGF-1可刺激鼻咽癌细胞的pERK表达增加,与对照组相比,CNE2细胞中p-ERK表达增加2.9倍,PD98059(50μmol/L)可明显抑制IGF-1激活鼻咽癌细胞pERK活性的上调。但总的ERK/MAPK蛋白表达不受影响(图3)。2.4小鼠细胞毒性变化随着Wortmannin浓度增加(0、10、50、100和200nmol/L),24和48h治疗后2条生长曲线逐渐下降,细胞生长明显抑制,以48h最明显,其IC50值24h后≤100nmol/L,48h后≤50nmol/L;随着PD98059浓度增加(0、5、25、50和100μmol/L),24和48h治疗后2条生长曲线也明显下降,细胞生长明显抑制,以48h最明显,其IC50值24和48h后均≤50μmol/L(图4)。3igf-1r、erk、mapk蛋白的表达PI3K/AKT通路在抗凋亡机制中发挥着重要的作用,同时也启动一系列与细胞周期调控、端粒酶活性、血管生成和细胞侵袭迁移相关的生物学程序。本研究结果显示,鼻咽癌组织和细胞株中AKT蛋白的表达水平高于慢性炎性组织;AKT的高表达伴有IGF-1R的过度表达,提示AKT的高表达在鼻咽癌的发生发展过程中起重要作用。本实验还发现,IGF-1可刺激鼻咽癌细胞的pAKT表达增加,而非磷酸化的AKT蛋白表达水平无明显改变。PI3K/AKT信号传导通路的特异性抑制剂Wortmannin(100nmol/L)可明显下调pAKT蛋白的表达水平,但总的AKT表达水平不受影响,提示磷酸化的AKT异常激活和表达升高与鼻咽癌细胞的浸润性生长有关,而并非总的AKT蛋白的表达增加。有研究表明,MAPK信号传导通路是细胞分化的关键调节因子,IGF-1R所激活的MAPK信号传导通路与细胞的生长和增殖密切相关。也有研究表明,ERK通路是哺乳动物中研究得最早、最深入,也是最重要的一条通路,在许多肿瘤组织中如肺癌、前列腺癌、黑色素瘤等恶性肿瘤都有pERK/ERK的高表达。本实验研究表明,鼻咽癌组织中ERK1/2蛋白的表达水平高于鼻咽炎性组织,ERK1/2的高表达也伴有IGF-1R的过度表达;pERK在鼻咽癌细胞中均可被IGF-1所激活。PD98059能部分阻滞pERK的激活,而总的ERK蛋白的表达无显著差异,而且不受PD98059的抑制,提示磷酸化的ERK异常激活和表达升高与鼻咽癌细胞的发生和生长增殖有关,而并非总的ERK/MAPK蛋白的表达增加。多项研究表明,IGF-1R及其下游2个主要信号传导通路PKB/AKT和ERK/MAPK是肿瘤发生发展过程中的关键因素,因此IGF-1R、PKB/AKT和ERK/MAPK可能成为非常有前途的抗癌治疗的重要靶物。在本研究结果中,低分化鼻咽鳞癌组织和细胞株中IGF-1R蛋白过度表达并伴有下游分子AKT、ERK蛋白的明显上调,IGF-1作用下pAKT和pERK磷酸化水平明显升高,AKT的抑制剂Wortmannin和ERK的抑制剂PD98059分别能有效地降低pAKT