生物反应器校准规范

JJF（湘）××—20231本规范适用于实验室用的搅拌式生物反应器的性能参数的校准，其他中试用生物反应器、光生物反应器、气升式生物反应器等相关反生物反应器一般是指用于进行是进行相应条件下微生物的培养、发酵，从而获取活用物理或化学的方法杀灭全部微生物，包括致病和非致病微生物、芽孢和朊病毒蛋菌落形成单位是指单位体积样品在琼脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的细JJF（湘）××—20232生物反应器一般是指用于进行是进行相应条件下微生物的培养、发酵，从而获取活体微生物或其所需的代谢产物的相应生产或实验仪器。生物反应器类型众多，本规范主要针对实验室使用的搅拌式生物反应器。中试生物反应器或其他类型反应器可参照本规图1常用生物反应器示意图生物反应器是一种利用酶或生物体（如微生物）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统。它主要通过在封闭或半封闭的无菌环境容器中，通过合适的技术手速、压力等条件进行监控，并利用监控结果进行反馈调节而控制罐体内环境的稳定，从而达到在充分利用底物的情况下获得较高的目标产物的目的。图1所示为常用的实验室JJF（湘）××—2023搅拌式生物反应器主要由反应器罐体、管路组件、监控传感器及配套的控制单元组成。管路组件包括进样管、取样管、进气管、排气管等。监控传感器包括温度传感器、恒温装置等。目前，大量生物反应器已经将监控显示和控制单元等都集成在电脑或控制面板上，便于统一进行设定、监控和联动管理。实验室用生物反应器一般以台式为主，罐体方便拆卸。部分实验室也会使用原位生物反应器，这类反应器一般会另外配备原位表1生物反应器的计量性能指标序号校准项目参考计量性能要求1温度温度示值误差±1.0℃温度波动度0.5℃2pH*pH示值误差±0.2pHpH重复性3转速转速示值误差±3%4溶解氧*溶解氧浓度示值误差±0.5mg/L溶解氧浓度重复性0.15mg/L5气体流量*气体流量示值误差±5%6液体流量*液体流量示值误差±5%液体流量稳定性5%7无菌性能测试*无菌落检出注1：以上技术指标不适用于合格性判定，仅供参考。计量性能指标也可参照反应器制造厂商给出的技术要求。注2：*根据反应器的适用项目，选择进行项目的校准。JJF（湘）××—202346.1.1供电电源220±22）V50±1）Hz。6.1.4室内应防潮、避光、防热、6.2.2pH有证标准物质：应使用经政府计量行政部检查待校生物反应器铭牌标识是否完好。将待校生物反应器开机预热，并确定生物器的温度探头放入反应器内，与标准数字温度计靠近放置于反应器同一水平面。在设定的温度点，同时分别读取生物反应器温度示值TR和标准数字温度计示值TS，分别读取三（1）____JJF（湘）××—2023器设置开启，使其处于工作状态。将标准数字温度计插入工作器温度探头位置，在反应器第一次达到设定温度后稳定至少10min或反应器使用说明书要求的稳定时间，开始读数。以每分钟至少6次的均器使用说明书中规定的时间。取最大值与最小值的差，换算为温度值，即为反应器在该ΔTf=Tmax-Tmin（2）按仪器操作要求，使仪器处于稳定工作状态。对待测反应器的酸度（pH）计传感探头，用一种标准溶液（对具有两点校准或多点校准方法的传感器，应选用两种或多种溶液校准）校准后，测量另一种标准溶液。测量点可根据实际常用点进行选择。进行重复测量操作6次，取平均值作为仪器示值，按式（3）计算该反应器的pH计传感器示值误差i——仪器示值平均值，pH；pHS——pH缓冲溶液标准值，pH；取6次仪器示值结果，按式（4）计算pH重SpH=σ1()2JJF（湘）××—20236i——仪器示值平均值，pH；pHi——单次仪器示值，pH；SpH——pH示值重复性，pH。按操作要求使仪器处于稳定工作状态。用新配制的无氧水（配制方法见附录A）对溶解氧探头进行测试、校准。随后，根据实际校准需求，配制准备好饱和溶氧水（配制氧水的标准值之差作为该生物反应器的溶解氧示值误差。若溶解氧传感器自带温度补偿溶解氧传感器操作可依据生物反应器的说明书执行，对不进行溶解氧监测的反应器可不ΔC=-CSSC=σ1)2（6）JJF（湘）××—20237光电转速表对准反光贴片位置测量实际转速，每档转速下测量3次，取平均值x标准，通过xi——转速设定值，r/min；x标准——转速测量平均值，r/min。根据仪器的计量需求，选择需要计量的液体蠕动泵对象（一般为碱泵、酸泵、补料通过管路系统，使计量对象管路中充满流动相。将温度计插入流动相，监控试验温度。分别进行测量。开启蠕动泵，当泵运行稳定后，选用事先称重的合适的容量瓶，分别接收规定时间流出的流动相。不同流速下的测量次数、时间建议如下表。将收集好流动相表2泵流速测定参数表3335Fm=Fm——流量实测值，mL/min；w2−w1pt×tJJF（湘）××—20238ρt——实验温度下流动相的密度（不同温度下流动相的密度参见附录B），g/cm3；Fs——流量设定值，mL/min。SR=Fmamin×100%SR——流量稳定性，%；选取实际常用的气体介质，将气体流量测量装置串联入气体流路中。调节反应器的气体流量计，选择用户常用范围内一个或多个的气体流量作为测量点，连续测量3次，Qs——气体流量设定值，L/min；δQ——气体流量相对示值误差，%。按操作要求以常规工作流程进行灭菌处理，选择用户常用的反应器准备流程和使用程序，进行培养反应24小时，或选择用户常用的培养时间，观察培养液中是否有菌体生成。同时，通过无菌操作对最终培养液进行取样，选择合适的培养基（一般与反应器使JJF（湘）××—20239h）如果与校准结果的有效性应用相关时，应对被校样品的抽样程序进行j）本次校准所用测量标准的溯源性及有效性说明；p）未经实验室书面批准，不得部分复制证书或报告的声明。由于复校时间间隔的长短是由仪器的使用情况、使用者、仪器本身质量等诸因素所决定的，因此送校单位可根据实际使用情况自主决定复校时间间隔。如果对仪器的检测JJF（湘）××—2023数据有怀疑或仪器更换主要部件及修理后应对仪器重新校准。生物反应器的复校时间间JJF（湘）××—2023在恒温水浴内灌入2/3容积的新鲜蒸馏水（约8L将多孔塑料浮盖浮于水面。水JJF（湘）××—2023t90(℃)0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.9999.099999.084999.069999.053999.038999.022999.006998.991998.975998.959998.943998.926998.910998.893998.876998.860998.843998.826998.809998.792998.774998.757998.739998.722998.704998.686998.668998.650998.632998.613998.595998.576998.557998.539998.520998.501998.482998.463998.443998.424998.404998.385998.365998.345998.325998.305998.285998.265998.244998.22420998.203998.182998.162998.120998.099998.077998.056998.035998.01321997.991997.970997.948997.926997.904997.882997.859997.837997.815997.79222997.769997.747997.724997.701997.678997.655997.631997.608997.584997.56123997.537997.513997.490997.466997.442997.417997.393997.396997.344997.32024997.295997.270997.246997.221997.195997.170997.145997.120997.094997.06925997.043997.018996.992996.966996.940996.914996.888996.861996.835996.80926996.782996.755996.729996.702996.675996.648996.621996.594996.566996.53927996.511996.484996.456996.428996.401996.373996.344996.316996.288996.26028996.231996.203996.174996.146996.117996.088996.059996.030996.001995.97229995.943995.913995.884995.854995.825995.795995.765995.753995.705995.67530995.645995.615995.584995.554995.523995.493995.462995.431995.401995.37031995.339995.307995.276995.245995.214995.182995.151995.119995.087995.05532995.024994.992994.960994.927994.895994.863994.831994.798994.766994.73333994.700994.667994.635994.602994.569994.535994.502994.469994.436994.40234994.369994.335994.301994.267994.234994.200994.166994.132994.098994.06335994.029993.994993.960993.925993.891993.856993.821993.786993.751993.716JJF（湘）××—2023送校单位： 制造厂家： 校准依据： 使用的标准器名称型号规格技术特征设定值/℃/℃ΔT/℃温度测量值/℃Tmax/℃Tmin/℃ΔTf/℃JJF（湘）××—2023液温pH有证标准物质/pH认定值/pHpH计测量值/pH平均值/pH示值误差/pH重复性/pH℃校准点1CRM编号：批号：校准点2CRM编号：批号：校准点3CRM编号：批号：标准值/(mg/L)测量值/(mg/L)平均值/(mg/L)示值误差/(mg/L)重复性/(mg/L)设定转速/(r/min)实际测量值/(r/min)平均值/(r/min)示值误差/%FS/(mL/min)W1/gW2/gT/minFmFmSSSRJJF（湘）××—2023设定流量/(L/min)实际测量值/(L/min)平均值/(L/min)示值误差/%校准员：核验员：校准日期：年月日JJF（湘）××—2023证书编号：××××-××××校准结果序号校准项目参考计量性能指标校准结果1温度示值误差±1.0℃2温度波动度0.5℃3pH示值误差±0.2pH4pH重复性5转速示值误差±3%6溶解氧浓度示值误差±0.5mg/L7溶解氧浓度重复性0.15mg/L8气体流量示值误差±5%9液体流量示值误差±5%液体流量稳定性5%无菌性能测试无菌落检出1.温度测量结果扩展不确定度：Urel=%，k=2；2.pH示值测量结果扩展不确定度：3.转速测量结果扩展不确定度：4.溶解氧测量结果的扩展不确定度：5.气体流量测量结果的扩展不确定度：6.液体流量测量结果的扩展不确定度：第×页，共×页JJF（湘）××—2023量和液体流量，参数都为使用标准器进行直接测量，测量结果受其他环境因素的影响可忽略。因此，主要分析测量过程中对测量结果影响较大的不确定度分量来源，对其进行度点。将反应器的温度探头放入反应器内，与标准数字温度计靠近放置于反应器同一水平面。在设定的温度点，同时分别读取生物反应器温度示值三次，取各自的三次平均值ΔT=R-S反应器温度探头测量过程引入的不确定度包括测量重复性引入的不确定度和仪器温JJF（湘）××—2023表E.1温度测量结果（单位：℃)测量次数123456789仪器温度示值37.037.036.936.936.936.937.037.137.137.0标准温度计示值37.0136.9236.8936.9336.9136.8536.9337.0237.0837.02sTi=σ1)2=0.08℃因仪器温度探头测量重复性和示值分辨力引入的分量相关，故标准不确定度取较大“Ti=“Ti1=0.05℃标准数字温度计测量过程引入的不确定度包括测量重复性引入的不确定度、和仪器sTs=σ1)2=0.08℃因数字温度计测量重复性和示值分辨力引入的分量相关，故标准不确定度取较大者uTs1。表E.2温度测量结果标准不确定度分量一览表标准不确定度分量不确定度来源标准不确定度值(℃)uTi温度探头测量过程引入0.05uTs标准数字温度计测量过程引入0.06根据仪器操作方法对待测反应器的酸度（pH）计传感探头进行校准。根据实际需求选择合适的pH标准溶液，使用仪器pH探头对pH标准溶液进行测量。重复测量操作6次，取平均值作为仪器示值结果，其与pH标准溶i——仪器示值平均值，pH；JJF（湘）××—2023pHS——pH溶液标准值，pH；对pH溶液标准物质（本例使用混合磷酸盐标准物质）进行测量，按测量方法重复测量表E.3pH测量结果（单位：pH）测量次数123456789仪器示值6.836.826.826.816.826.816.816.816.806.81反应器pH探头测量过程引入的不确定度包括测量重复性引入的不确定度和pH示值SPHi=σ1()2=0.009pH辨力引入的标准不确定度“pHi2：“pHi=“pHi1=0.004pHpH溶液标准物质引入的不确定度包括标准物质本身量值的不确定度和温度对pH值JJF（湘）××—2023在不同温度下，pH标准物质的pH是不同的。硼砂为原料的pH标准溶液温度系数MPE——温度探头测温的最大允许误差，本UpHS=UpHS12+UpHS2表E.4pH测量结果标准不确定度分量一览表标准不确定度分量不确定度来源标准不确定度值（pH）upHipH测量过程引入0.004upHSpH溶液标准物质引入0.006根据仪器操作方法对待测反应器的溶解氧传感探头进行测试、校准。根据实际需求次，取平均值作为仪器示值结果，其与饱和溶氧______本示例中选取一台生物反应器，仪器运行至恒温稳定。使用仪器溶解氧探头进行测表E.5溶解氧测量结果（单位：mg/L）测量次数123456789仪器示值8.238.258.328.318.288.278.318.318.258.26反应器溶解氧探头测量过程引入的不确定度包括测量重复性引入的不确定度和溶解sci=σ1)2=0.032mg/Luci1=0.013mg/Luci2=0.003mg/L因仪器溶解氧探头测量重复性和示值分辨力引入的分量相关，故标准不确定度取较在不同温度和大气压力下，饱和溶氧水的溶解氧浓度是不同的。饱和溶氧水引入的升高0.1kPa引起的溶解氧变化的系数为0.085mg/L/kPa。本示例恒温水槽的均匀性为定度为UP=0.05kPa，k=2。各引入的不确定度变量不相关，则，本示例中饱表E.6溶解氧测量结果标准不确定度分量一览表标准不确定度分量不确定度来源标准不确定度值（mg/L）uCi溶解氧测量过程引入0.013uCS饱和溶氧水溶液0.047uC=uCi2+uCS2=0.049mg/L≈0.05mg/L将反光转速贴片贴于搅拌器旋转叶片或转动轴上，根据实际情况设置合适的转速测量点。用光电转速表对准反光贴片位置测量实际转速，重复测量3次，取平均值x标准，并xi——转速设定值，r/min；x标准——转速测量平均值，r/min。本示例中选取一台生物反应器，仪器运行至搅拌电机运行转速稳定。使用光电转速表E.7转速测量结果（单位：r/min）测量次数123456789实测值STi=σ1)2=0.25r/min表E.8转速测量结果相对标准不确定度分量一览表标准不确定度分量不确定度来源相对标准不确定度值（%）ur1转速重复测量过程引入ur2标准器引入0.005ur3搅拌电机分辨力0.24urx=ur12+ur22+ur32=0.27%≈0.3%JJF（湘）××—2023根据生物反应器的配置需求，选择相应的蠕动泵及管路。选择适配的管路连接液体管路出口、入口，以纯水作流动相，通过管路系统运行，使其充满流动相。将温度计插开启蠕动泵，运行稳定后，选用事先称重的合适的容量瓶，分别接收规定时间流出的流动相。将收集好流动相的容量瓶在分析天平上称重，重复三次，分别计算流量的实测值Fs——流量设定值，mL/min。Fm=(W2-W1)/(ρt×t)Fm——流量实测值，mL/min；ρt——实验温度下流动相的密度，g/cm3；JJF（湘）××—2023表E.9液体流量测量结果（单位：mL/min）测量次数123456789实测值9.979.949.98SFm=σ1()2=0.05