在线固相萃取-液相色谱串联质谱法检测牛奶中14种磺胺类药物

在线固相萃取-液相色谱串联质谱法检测牛奶中14种磺胺类药物

1在线固相萃取技术检测药物的可行性固相萃取（spe）使用固体吸附剂吸收液体样品中的目标化合物，并将样品的基质和干扰物质分离，然后用洗涤剂去除，以达到分离和提取目标化合物的目的。样品中目标物质的分离和富集是色谱分析中必不可少的一部分,因此固相萃取技术作为一种传统的前处理手段已被广泛应用于色谱分析的各个领域。常用的固相萃取主要有分散相固相萃取和填料柱固相萃取这两种方式[1~4],通过这些手段可以达到去除试样中的干扰物质,使痕量组分得到富集便于检测和分离,保护色谱分析柱等目的。然而,传统离线固相萃取常需繁琐的手工操作才能完成,比色谱分离和数据处理等花费更多的时间。近年来,随着液相色谱仪技术的迅速发展,仪器的自动化程度越来越高,样品的前处理技术实现自动化成为了一种新趋势。在线固相萃取技术传统填料柱固相萃取和分散相固相萃取相比具有节省人力和耗材,提高前处理稳定性和缩短检测时间的优势。磺胺类药物是具有对氨基苯磺酰胺结构的一类广谱抗菌药物的总称,兽医临床和畜牧养殖业中被广泛应用于预防和治疗细菌感染性疾病。但是磺胺药会引起人过敏性反应,且可能有致癌性,其不合理使用使其在动物性食品中残留,引起生态环境污染,危害人类健康。针对该情况开发了各类检测方法,其中较为常见的有酶联免疫法,HPLC法和UPLC-MS/MS法等。据文献报道,采用酶联免疫法快速检测牛奶中的8种磺胺类药物,其检测限可达5μg/L,灵敏度较高,检测通量大,可以用来做大规模筛查,但无法很好区分磺胺药物种类;使用高效液相色谱法结合基质固相分散前处理法检测牛奶中8种磺胺类药物,其方法灵敏度可达0.05mg/L,但其分析时间较长且灵敏度偏低;有报道超高效液相色谱-串联质谱法单针进样可在10min内同时检测24种磺胺类药物,其检测灵敏度高,方法特异性好,但是前处理步骤过于简单,在检测大量样品时容易造成杂质对分析柱和质谱源区的污染。为保障目前市售牛奶的食品质量安全,防止磺胺类抗菌药在奶牛养殖环节的违法滥用,本实验采用在线固相萃取结合液质联用技术检测牛奶中14种常见磺胺类药物,利用双三元液相的程序控制流路切换功能实现了在线固相萃取,解决了牛奶基质中乳脂和蛋白对仪器的干扰和污染;克服了使用传统固相萃取技术带来的耗材成本高,人力耗费大等缺点;提高了检测通量和稳定性,具有更简捷、经济和稳定的特点。2实验部分2.1高速冷冻离心系统n-evapUltiMate3000双三元超高效液相色谱,变色龙色谱控制软件,TSQQuantiva串联四级杆质谱带HESI电离喷雾源,Xcalibur数据处理系统,RetainCX阳离子交换在线SPE柱(3.0mm×2.1mm),HypersilgoldC18分析柱(100mm×3.0mm3.0μm),以上均为美国ThermoFisher公司产品。AllegraX-22R高速冷冻离心机(美国BeckmanCoulter公司);N-EVAP水浴控温氮吹仪(Anpel公司)。磺胺醋酰(Sulfacetamide,STD)、磺胺吡啶(Sulfapyridine,SPD)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine,SDZ)、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole,SMZ)、磺胺噻唑(Sulfathiazole,ST)、磺胺甲嘧啶(Sulfamerazine,SMR)、磺胺曲沙唑(Sulfatroxazole,STX)、磺胺甲噻唑(Sulfamethizole,STZ)、磺胺苯甲酰(Sulfabenzamide,SBZ)、磺胺二甲基嘧啶(Sulfadimidine,SDMD)、磺胺甲氧哒嗪(Sulfamethoxypyridine,SMPD)、磺胺氯哒嗪(Sulfachloropyridazine,SCP)、磺胺二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine,SDM)、磺胺苯吡唑(Sulfaphenazole,SP),纯度均大于≥99.0%(德国DrEhrenstoferGmbH公司);氨水(分析纯,上海振兴化工厂);甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯,德国Merk公司);去离子水(自制,电阻率≥18MΩcm);高纯氮、高纯氩(99.999%,上海佳杰特种气体公司)。2.2实验方法2.2.1离心条件的制备准确称取摇匀后牛乳5.00g(精确至0.01g),置于50mL离心管中,加入15mL乙腈,具塞振荡30s,摇匀后,8000r/min离心3min;取上清液至另一个50mL离心管中,50℃氮气吹干后,加入1.00mL0.2%甲酸溶液充分溶解,过0.22μmPTFE滤膜,准备上机净化测定。2.2.2色谱-质谱条件在线富集净化色谱柱为RetainCX(20mm×3.0mm),进样流路使用20μL溶剂混合器,流动相A为5%氨水-甲醇溶液,B为甲醇,C为0.2%甲酸溶液。分析色谱柱使用HypersilgoldC18(100mm×3.0mm,3.0μm),分析流路使用200μL溶剂混合器,流动相:A为5%氨水-甲醇溶液,B为乙腈,C为0.2%甲酸溶液。进样量10μL,柱温30℃,进样流路流动相比例切换采用六位切换阀进行瞬变切换,分析流路流动相比例采用匀速梯度变化,梯度程序见表1,切换阀流路装配见图1。2.2.3定性离子检测质谱检测器为ThermoFisher公司的TSQQuantiva串联四级杆质谱带HESI电离喷雾源,选择正离子模式,源电压为3500kV,鞘气(Sheathgas)压力344kPa,辅助气(Auxgas)流速5L/min,吹扫气(Sweepgas)流速0.3L/min,离子传输管(Iontransfertube)温度350℃,雾化器(Vapourizer)温度400℃,离子透镜(RSLens)电压为70V,检测模式为选择反应监控(Selectedreactionmonitoring,SRM),碰撞气压力0.2Pa,Q1段分辨率设为半峰宽0.4,Q2段分辨率设为半峰宽0.7,14种磺胺类药物的定性与定量离子对以及对应的撞击能量见表2。2.2.4标准曲线进样范围将14种磺胺类药物对照品分别用甲醇溶解,制成1mg/L的标准品贮备液,取适量该贮备液,用0.2%甲酸-乙睛(15∶85,V/V)稀释成0.5,1.0,2.0,5.0,10.0和50.0μg/L的标准曲线系列工作溶液,将此系列溶液依次按2.2.2和2.2.3节的方法进样检测,所得定量通道色谱图积分后面积以A表示,进样浓度以C表示,回归曲线见表3,其线性相关系数r≥0.999,证明本方法在0.5~50μg/L的进样浓度范围内线性良好,其对应的检测方法检测含量范围为0.1~10μg/kg。3结果与讨论3.1源电压的选择通过蠕动泵以10μL/min的速度向质谱仪中注入含有1mg/L14种磺胺类化合物的混合标准工作液。将鞘气压力设为34kPa,辅助气流速设为0.3L/min,吹扫气设为0,在2000~4500kV范围内依次以100kV增加源电压,并检测目标化合物的[M+H]+分子离子峰绝对响应。实验表明,当源电压设为3500kV时,大部分磺胺类化合物的[M+H]+分子离子峰绝对响应达到最大值;之后,随着源电压上升,响应没有显著增加;到3800kV之后甚至有下降趋势,且源区有微弱电弧光显现。推测可能是电压太高而造成雾化后的微液滴电荷过载,发生击穿放电现象,此现象导致进入离子传输通道的带电粒子数下降。因此,源电压选择3500kV。另外,在被检测的化合物中,SPD与SDZ分子离子的质荷比仅差1,SMZ与ST之间,SBZ与SDMD与SMPD之间的质荷比仅差2,因此有必要提高Q1段的质量数分辨率,避免相互之间的干扰。将Q1段的质量数分辨率从原来的半峰宽0.7提高到0.4,这样可能会损失一定的响应值,但是可以很好地解决质量数接近的分子离子互相干扰问题,有效提高信噪比。3.2色谱质谱条件的选择在线固相萃取(OnlineSPE)是通过控制两台独立工作的液体传输泵和切换阀使用程序分别进行检品的富集净化和分析,需要有一台泵负责进样和富集净化功能,使目标化合物在在线固相萃取柱上实现保留富集和洗涤;通过阀切换,使用另一台泵进行样品的过柱分离和检测。选择合适的在线固相萃取柱和设计合理的富集净化和洗脱条件是在线固相萃取方法的关键,本方法选择RetainCX作为在线SPE柱,RetainCX的富集净化机理为阳离子交换结合反相机理,磺胺类药物大多为碱性化合物,使用阳离子交换结合反相模式的在线固相萃取柱具有更好的富集净化效果。在进样时进样泵的流路采用甲醇-0.2%甲酸(10∶90,V/V)为流动相,可在富集磺胺类药物的同时清洗部分极性较大的杂质,通过在线分析柱后直接连接质谱检测器,发现采用此流动相并无目标化合物的流失(图2a)。选择5%氨水-甲醇溶液作为洗脱液,通过阀切换,使用分析流路进行洗脱和分析,分析流路应在阀切换之前先用洗脱溶液充满流路,这将有助于更快地在阀切换之后集中将目标化合物洗脱,避免因为分析流动相造成在线净化柱上目标化合物的扩散而造成目标峰展宽。将流路中的分析柱拆去,用两通替代,可以获得目标化合物的洗脱时间约为4.2min(图2b)。据此可以确定,阀切换的时间应该略晚于此时间,但不应过长而导致部分低极性杂质进入分析流路。由于5%氨水-甲醇洗脱剂和0.2%甲酸-乙睛(15∶85,V/V)分析流动相的差异较大,容易由于溶剂化效应而造成色谱峰展宽,因此洗脱时采用较低的流速0.4mL/min,减小进样溶剂的总量;此时分析流路使用较高流速0.8mL/min,并将洗脱剂中5%氨水-甲醇比例下降至70%,有效消除了溶剂化效应(图2c)。3.3方法的检出限和定量下限选择20个空白样品,按优化条件进行处理后上机测定,取与标准品图谱中相同保留时间的噪音信号平均值,以信噪比S/N≥3为检出限(LOD),S/N≥10为定量下限(LOQ),确定该方法对盐酸赛庚啶的检出限为0.05μg/kg,定量下限为0.1μg/kg。经过实际进样检测后,检测定量限附近峰型良好。3.4固相萃取法优化磺胺类化合物为研究在线固相萃取和传统固相萃取法检测牛奶种14种磺胺类药物时方法回收率和