光谱分析法概论课件

第十一章光谱分析法概论汇报人：某某某汇报时间：2023.X.X根据物质发射的电磁辐射或物质与辐射的相互作用，建立起的仪器分析方法统称为光学分析法。该法包含三个主要过程：能源提供能量能量与被测物相互作用产生检测信号第一节电磁辐射及其与物质的相互作用（一）电磁辐射和电磁波谱

光是一种电磁辐射（又称电磁波），它具有波粒二象性。其波动性用波长λ、波数σ和频率ν作表征：ν=C/λ

σ=1/λ=ν/C

光的微粒性用每个光子的能量E作表征：

E=hν=hC/λ=hCσh：普朗克常数（Plankconstant）

光的能量和波长成反比。

（二）电磁辐射与物质的相互作用

当电磁波通过固体、激发态液体或气体等透明介质时E光=ΔE粒子，若：

E电磁波=ΔE分子（原子）基态介质粒子就会选择性地吸吸收光谱收能量，从基态跃迁到激发态，利用该现象进行光谱分析的方法叫吸收光谱法。

吸收了外界能量（电磁辐射能、电能和热能等）而处于激发态的粒子在返回到低能级或基态时，以电磁辐射的形式释放出激发态

多余的能量，利发光用该现象进行光谱分析的方法叫基态

发射光谱法。发射光谱

电磁辐射的产生或吸收，是物质内部运动变化的一种客观反映。所以电磁波谱内的所有波谱区都可用于物质的分析测定。

P181表10-1列出了分析中常用的电磁波谱区的名称、波长范围、能量大小及与其相应的物质内部能级跃迁类型、分析应用的波谱类型。

波谱区波长范围能级跃迁类型应用类型γ-射线0.0005～0.014nm

核γ-射线发射谱X-射线0.014～10nm原子内层电子

X-射线吸收、发射谱远紫外10

～200nm原子及分子可见与紫外吸收近紫外200～400nm外层电子原子吸收与发射可见区400～760nm分子与原子荧光分子磷光光谱近红外0.76～2.5μm分子振动中红外2.5～50μm红外吸收光谱远红外50～1000μm分子转动微波区0.1～100cm电子自旋顺磁共振波谱射频区1～1000m核自旋核磁共振波谱第二节光学分析法的分类

按照电磁辐射能量的不同，与物质间作用机理不同，产生的物理现象不同，建立各种不同的光学分析方法。例：

光谱法物质与电磁辐射相互作用时，记录能级跃迁时光强度随波长变化（即光强-λ曲线图谱）。

非光谱法测定电磁辐射的某些性质变化（反射、衍射、折射和偏振等）

光谱机理光谱形状应用原子气态原子（离子）线状测元素外层电子能级跃迁组成含量分子分子外层电子能级带状定性定量（包含振-转能级）结构分析的跃迁

分子运动包含对应能级产生波谱

外层电子运动电子能级Ee紫外可见原子间的相对振动振动能级Ev近中红外分子的转动转动能级Ef远红外

所以，分子能量

E分子=Ee+Ev+Ef

电子光谱（紫外-可见光谱）实际上是电子-振动-转动光谱，表现出复杂的结构。由于仪器分辨率及测试条件的影响，电子光谱中振动和转动能级跃迁所产生的谱线结构一般分辨不出，观察到的只是这些谱线展宽后合并在一起的较宽的吸收带。因此，分子光谱常以带状为其特征。单击此处添加大标题内容

吸收光谱紫外-可见吸收光谱原子吸收光谱

发射光谱分子荧光光谱

质谱法确定分子式、分子量和分子结构第三节发展概况

光谱分析是研究最多和应用最广的分析技术之一。上世纪70年代以来，计算机和化学计量学的发展，推动了光谱分析方法和仪器的发展。一机多能或多机联用，吸取其它学科的新成果，创立新的分析方法是光谱分析发展的新途径。第十二章紫外-可见分光光度法

ultravioletandvisible

spectrophotometry

概述

研究物质在紫外-可见光区分子吸收光谱的分析方法定性：有机物官能团鉴别、异构物的判别定量：单组分定量、多组分不经分离定量灵敏度:10-4～10-6g/ml准确度：一般0.5%，精密仪器达0.2%波长范围:200～800nm

紫外:200～400nm

可见光:400～800nm第二节基本原理P198（一）Lambert—Beer定律该定律是物质对光吸收的基本定律，是分光光度分析法的依据和基础。

Lambert定律：吸光物厚度与物质对光的吸收度成正比关系；

Beer定律：吸光物浓度与物质对光的吸收度成正比关系。第一节基本原理

一束平行单色光L通过一个含吸光质点的物体，一些光子被I0I吸收，光强就从I0

降到I。光吸收基本定律（朗伯-比尔定律）：

定律推导：ι

S：截面积ι

：厚度I0In：吸光质点总数目s取厚度无限小的薄层，设：

dn：薄层中吸光质点数目

ds：薄层中捕获光子的质点面积则：ds=kdnk：比例系数光子通过薄层被吸收的几率：

若：Ix

：进入薄层的光强

dIx：薄层内被吸收的光强则光在薄层中减弱分数光通过厚度为ι

的吸光物体时减弱的程度两边乘lge

∵

∴n=CV基本概念1、透光率T

透光率T:0～1

百分透光率T%:0～100

2、吸光度A

3、A与T的换算

4、吸光系数Eλ物理意义：指某波长时，吸光物在单位浓度及单位厚度时的吸光度。一定条件下，吸光系数是物质的特定常数。同一物质，在相同条件下，对同一波长的单色光具有相同的吸光系数。是定性参数。

（1）摩尔吸光系数ε

某波长时，吸光物浓度为1mol/L，厚度为1cm时的吸光度。（2）百分吸光系数某波长时，吸光物浓度为1%（ｇ/ｍｌ）或1g/100ml，厚度为1cm时的吸光度。

注：1%（ｇ／ｍｌ）是重量除以体积的百分数，重量用克作单位，体积用ml作单位。例：1g/100ml×100=1%（ｇ／ｍｌ）（3）ε

和间换算

把浓度单位代入经推导得：（4）吸光系数的测定A、配制一定浓度的对照品溶液。B、在一定波长下测定该溶液的吸光度。C、计算：5、吸光度A的加和定律

若溶液中存在两种或两种以上的吸光物，只要这些组分之间不存在相互作用，则总吸光度是各共存吸光物的吸光度之和。6、吸收光谱：A～λ曲线特征值：A吸收峰λmax

谷λmin肩峰λsh末端吸收纵坐标不同，（A～λ→T～λ）：曲线形状不同，特征值不变；λmaxλshλmin

λ浓度不同：高度改变，特征值不变

TAλλλE曲线深度随浓度而变化，但不成线性曲线高度与浓度成正比，形状不随浓度改变曲线形状和高度与浓度无关AC正偏差负偏差标准曲线吸光度与浓度关系偏离Beer定律示意图（二）偏离Beer定律的主要因素

(一)化学因素

1、比尔定律在描述稀溶液对单色光的吸收时才成立原因：浓度较大时，①吸光粒子距离减小，影响其电荷分布，使其吸收给定波长光的能力改变；②溶液对光折射率有显著改变;③吸光物有离解、缔合或与溶剂的相互作用。例：K2Cr2O7水溶液AC增大，[H2O]减小

平衡左移，浓度比值增大，

350450λ450nm测定；A

直线向上弯曲；350nm测定：直线向下弯曲

C解决方法：（1）酸性条件下测（2）碱性条件下测（3）等吸收点（）波长处进行测定（二）光学因素

1、非单色光

Beer定律只适用于单色光，由于仪器制作和测量技术限制，实际用于测量的是一定波长的复合光。

谱带宽S：S=λ2-λ1

入射光在透光曲线上光强减至最大值一半时的波长范围。

S越小，光的单色性越好。λ1λ2λ复合光对A-C关系的影响

λ1I01I1

λ2I02I2∴

代入：A=-lgT经整理得；当E1=E2

A与C成线性；

E1≠E2A与C不成线性若λ1是测量波长，λ2光影响如下：

E2>E1

式子第二项是正数，A增大，正偏差E2<E1

式子第二项是负数，A减小，负偏差

例如：右图所示的某AⅠ吸收光谱，用谱带ⅠⅡ还是谱带Ⅱ所对应的波长进行分析？

通常选择吸光物

λ的最大吸收波长作为测定波长。原因：①测定灵敏度较高；②此处曲线较为平坦，吸光系数变化不大，对Beer定律偏离程度比较小保证一定光强的前提下，用尽可能窄的谱带宽度，并避免在尖锐的吸收峰处测定。λ1λ2λA测量波长的选择

2、杂散光（straylight）入射光中有一些不在谱带宽范围内，与所需波长相隔较远的光。产生：仪器设计制造的瑕疵或使用保养不善设：杂射光强Is样品不吸收Is

产生负偏差样品吸收Is

产生正偏差一般来说，绝大部分波长内杂散光的影响可忽略不计，但在接近光源末端处，因光源强度和检测器灵敏度均较弱，杂散光的比例相对增大而干扰测定，有时还会出现假峰。如用紫外光源时，220nm以下杂散光迅速增大；用钨灯作为光源时，350～400nm波长杂散光影响显著。3、散射光和反射光

I0I

测量A值时，光强度的减弱并不完全是吸光物散射的吸收，还有：①溶剂、容器的吸收反射反射②吸光质点的散射③吸收池内、外界面的反射解决办法溶剂测定波长范围应基本无吸收溶剂截止波长P260吸收池紫外光用石英池，同一套池有一致的透光性用空白溶液补尝配制空白液（不含被测组分，其它成分与试液基本相同），测定时有3步骤：（1）、遮住光路，用电子线路调T%=0%（2）、入射光照射空白液，调T%=100%（3）、入射光照射样品液，读T%=I/I0%

把透过空白液的光强作为I0，基本抵消了因界面反射、吸光质点散射和溶剂、容器等的吸收而产生的影响。

若存在以下两种情况，则不能完全用空白液补尝：(1)、大分子试样（胶体、蛋白质类）或浑浊试样，因质点大，散射光强，不易配制相同的空白液补尝，使透射光减弱，A值偏高(2)、试样溶液与空白溶液的折射率有较大的差异4、非平行光非平行光增大光通过液层的厚度，使A值偏高。样品池架的机械定位，吸收池不得倾斜放置光路中

i（二）透光率测量误差及对测定结果的影响

仪器测量T值过程中，存在一定幅度的偶然误差ΔT，它对测定结果相对误差的影响推导如下：

（1）微分：（2）（2）÷（1）：或引起ΔT暗噪声其造成ΔT是一常量讯号噪声若仪器暗噪声造成ΔT=0.5%，A取值0～1，代入上式得：

0.20.430.7AA0.1550.2220.3010.3990.5230.6991.002.01.631.441.361.381.552.17在A=0.2~0.7

（T%=65%~20%）暗噪声引起<2在A=0.4343时，暗噪声引起最小。暗噪声讯号噪声

A

在A=0.2~较高A值，讯号噪声引起较小

ΔT=0.005的仪器，应使测量值落在A=0.2~0.7范围。

结论1、仪器的ΔT=0.5%时，若要求浓度的测量相对误差＜2%，应通过控制溶液的浓度或厚度使测得的A值落在0.2～0.7

左右。2、对高精度的分光光度计，ΔT可低达0.01%,误差较小的范围可延伸到高吸收度区（A

为0.2～2）。

第三节紫外-可见分光光度计

商品仪器种类很多，性能差别悬殊，但基本设计原理相同。光路方框图（一）主要部件

1、光源要求光强足够和稳定具有连续光谱光源单色器吸收池检测器讯号处理及显示器可见光区：

钨灯固体炽热发光卤钨灯>350nm使用，需稳压。

紫外光区：

氢灯气体放电发光

氘灯约200nm~350nm使用，需稳流。2、单色器

作用：从来自光源的复合光中取出所需波长的单色光

构成：进（出）口狭缝、准直镜及色散元件等

原理：复合光进入进光狭缝，经准直镜变平行光，投射于色散元件，色散元件使不同波长的平行光有不相同的投射方向，经准直镜聚集在出光狭缝，转动色散元件的方位，使所需波长的光从出光狭缝分出。混合光单色光λ1λ2准直镜出光狭缝色散元件进光狭缝图12-13单色器光路示意图（λ2>λ1)

复合光进入进光狭缝，经准直镜变平行光，投射于色散元件，色散元件使不同波长的平行光有不相同的投射方向，经准直镜聚集在出光狭缝，转动色散元件的方位，使所需波长的光从出光狭缝分出。（1）色散元件

棱镜光栅滤光片色散率：相差一个单位的波长的光被分开的角度。

①棱镜色散原理：对不同波长的光有不同的折射率

构造：600透射式，300反射式可见光区：用玻璃或石英棱镜紫外光区：石英棱镜

色散率：长波长区色散率低，单位波长被分开角度小短波长区色散率高，单位波长被分开角度大

βd350450300500700900三级二级一级167233300150250β蓝红棱镜紫光栅红蓝紫图12-14棱镜色散与光栅色散②光栅色散原理：光被衍射所产生的干涉作用

构造：高度抛光表面上刻出大量平行、等距离的槽色散特点：色散率不随波长而变有多级色散（要用滤光片滤去高级序光谱）③滤光片

带通吸收某些波长而获得有限

吸收

截止波长（S=30～50nm）

干涉借光的干涉作用产生较窄的谱带（S=10nm）

III

λ

λ

λ

带通截止干涉（2）准直镜镀铝的抛物柱面反射镜作用：将进入单色器的发散光变成平行光，将色散后的平行单色光聚集于出口狭缝。（3）狭缝

宽度适当过宽：单色光不纯过窄：光强度太小，测定灵敏度下降

3、吸收池

可见光区：玻璃或石英池紫外光区：石英池

盛空白、样品的吸收池，应有相同厚度和透光性。必要时校正吸收池

4、检测器光电转换器

光电池光电管光电倍增管光二极管阵列检测器

（1）光电池

光敏半导体，光照产生电流，一定范围，光强与电流成正比。

硒光电池

:用于可见光区

硅光电池：用于紫外-可见光区特点：光电池内阻小，电流难放大，用微电流计直接测，适于单色光谱带宽S较大的低档仪器；易“疲劳”。（2）光电管

特点：内阻较大，光电流易放大紫敏光电管：200nm～625nm

红敏光电管：625nm～1000nm

构造：阳极和光敏阴极组成的真空二极管图2-15光电管检测示意图1、照射光2、阳极3、光敏阴极4、90V直流电源5、高电阻6、直流放大器7、指示器（3）光电倍增管

构造：与光电管相似，但在阳极和阴极之间增加了9个倍增极。特点：灵敏度更高图12-16光电倍增管示意图（4）光二极管阵列检测器（photodiodearraydetector）

构造与原理：

晶体硅上紧密排列一系列光二极管检测器，光透过晶体硅时，二极管输出的电信号与光强成正比。二极管数目越多，分辨率越高

特点：能快速光谱采集例：HP8452A型二极管阵列，在190nm～

820nm范围内，由316个二极管组成。每一个二极管，可在1/10秒内，每隔2nm测定一次，可同时并行测得316

个数据，1/10秒就获得全光光谱。二极管123……316测定λ（nm）190192194……820

而一般分光光度计（光电管或光电倍增管），波长测定范围和间隔不变，测定速度1/10秒，则从190nm～820nm，需扫描31.6秒才得全部数据。5、讯号处理与显示器将讯号放大并显示结果。包括一些数学运算过程。显示器：电表指针读数数字显示荧光屏显示打印结果曲线扫描等

（二）、分光光度计的光学性能与类型1、光学性能：

7501紫外-可见分光光度计波长范围：200nm~900nm

波长准确度：波长重现（复）性：0.5nm

透光率测量范围：0~150%

吸光度测量范围：-0.17~2.00

光度准确度：0.5%(T)

光度重复性：0.5%(T)

分辨率：0.1nm

杂散光：<0.5%(220nm,340nm,NaI(1%g/ml))

2、几种光路系统

①单光束分光光度计②双光束分光光度计

③光多道二极管阵列检测的分光光度计图12-17单光束分光光度计光路示意图1、氘灯2、钨灯3，5、平面反射镜4、聚光镜6、进口狭缝7、滤光系统8，9球面反射镜10光栅11出口狭缝12柱面透镜13吸收池14光电倍增管

（1）单光束分光光度计

结构与原理：从光源到检测器只有一束光，用空白液调T%=100%和测定试样液，都在同一位置，用同一束光先后进行。特点：结构简单，但对光源发光强度的稳定性要求较高。1，2同步斩光器（旋转扇面镜）3单色器出光狭缝4、5，6，7，8、凹面镜9、平面镜10，11、参比与样品吸收池12、光电倍增管图12-18单波长双光束分光光度计示意图（2）双光束分光光度计增加了两个同步旋转的扇形镜，使两束光分时交替地通过空白池和样品池（交替速度几十～几百转/每秒），减免光源强度不稳引入的误差。

图12-19二极管阵列分光光度计光路图光源吸收池光闸入口狭缝消色差聚光镜二极管阵列检测器全息光栅消色差聚光镜（3）光多道二极管阵列检测的分光光度计

一种具有全新光路系统的仪器，在极短时间内可得全光光谱。（三）分光光度计的校正1、波长的校正短波长区校正：苯蒸气吸收光谱或苯-乙醇光谱中波长区校正：氘灯发射谱线常用486.02nm（F线）和656.10nm（C线）长波长区校正：镨钕玻璃的吸收光谱图12-20镨钕玻璃滤光片的吸收光谱λnm

2、吸光度的校正

《中国药典》2005年版规定采用约60mg/L的K2Cr2O7的硫酸溶液（0.005mol/L），在规定的波长处测定并计算吸光系数，再与规定的吸光系数比较。相对偏差应在±1%以内。

3、吸收池检查及校正使用一段时间后，磨损和污染会造成透光性能差异，必要时进行检查和校正。第四节紫外-可见吸收光谱常规分析

方法一、定性鉴别：1、依据：多数有机化合物具有紫外吸收光谱特征。

①特征值：

②吸收光谱形状同一化合物，在相同条件下应具有相同的吸收光谱（即吸收曲线）2、定性鉴别方法：对比法：（1）对比吸收光谱特征数据是否一致（2）对比吸光度比值或吸光系数比值例如：维生素B12的定性鉴别(（3）对比吸收光谱一致性

同样条件下，进行：

对照品光谱曲线试样光谱曲线与对照或文献记载标准图谱

紫外光谱作定性鉴别有其局限性，因光谱只有一个或几个宽吸收带，特征性不强，形状变化不大。

特别指出：

在相同条件下，具有相同吸收光谱的物质，可能是同一物质。若在相同条件下，吸收光谱不同，则肯定不是同一物质。醋酸氢化可的松醋酸泼尼松醋酸可的松图12-22三种甾体激素的紫外吸收光谱（10μg/ml甲醇液）二、纯度检测

1、杂质检查

被检物有吸收，杂质无或弱吸收选某λ，被检物弱吸收，杂质较强吸收

E测<E纯若有杂质，

E测>E纯

2、杂质限量检查药物所含杂质，常制定一个允许其存在的最高限量，超过该值，会影响疗效或引起副作用，药物就不合格。

药物无吸收选λ测配杂质最高限量液C限杂质有吸收测定A值，作为A限，若被检药物A>A限，则该药品不合格。三、单组分样品的定量方法

（一）吸光系数法从手册或文献查出E，同条件下测试样A，则：（二）标准曲线法(用于谱带宽较大仪器)

配制一系列不同浓度的标准溶液（5个），分别测A值，同条件下测样品A样值（1）、作图法

A

标准曲线查出C样

A样（2）、直线方程求解法求A=a+bCC样

C

计算样品含量(方程求解参看P31～P32)

若仪器单色光谱带宽S较大，单色光不纯，就不能用吸光系数法定量。因这时E值随所用仪器的不同而变化。但若固定仪器、固定工作状态和测量条件，C和A在很多情况下（尤其较低浓度时）仍成线性关系：A=KC。但K不再是物质的特性常数，只是个别具体情况下的比例常数，不能通用，这时定量必须用标准曲线法。（三）对照法

同条件下，分别配制标准溶液和试样溶液，在选定的λ处，测A值。标准溶液：A标=EC标样品溶液：A样=EC样两式相除：该法要求：①A-C曲线过原点②C标≈C样，且在线性范围药物测定中常用方法：测标准品A标，求（或查文献）；测样品A样，求得：按样品配制浓度算出的E值（非物质特性常数）按纯品浓度算出的E值（是物质特性常数）推导：（1）

（2）（3）（2）、（3）代（1）得：证毕例题：维生素B12样品25.0mg溶解配成1000ml，在1cm厚度的吸收池测得A361nm=0.507

，求样品含维生素B12的重量百分含量。（已知维生素B12

的）方法一解：样品配制浓度C=25.0mg/1000ml=0.00250g/100ml例题：维生素B12样品25.0mg溶解配成1000ml，在1cm厚度的吸收池测得A361nm=0.507，求样品含维生素B12的质量百分数。（已知维生素B12

的）方法二解：样品含维生素B12的量

四、多组分样品的定量方法—

计算分光光度法

定量依据：

1、Lambert—Beer定律

2、吸光度加和性质

以下为讨论简化，设吸收池厚度

=1cmAba

λ2λ1λ

各组分的λmax处，其它组分无吸收，可按单组分的测定方法处理：

λ1处测定a组分；

λ2处测定b组分。

样品液含a、bAba

两组分，A—λ

曲线如右图：按A的加和性质；λ2λ1λ

由样品液测：

a纯品液测b纯品液测解方程组得：Ca，Cb解联立方程组的方法从数学角度，测定波长点数≥被测组分数，就可建立联立方程组，解决多组分混合物的测定。实际上λ的选择很重要，要考虑：①所选λ，A与C成线性，A符合加合性质；②各组分的E值较大；③尽量选峰顶，避免选陡坡。这样计算很复杂，有时测定误差较大。上世纪五十年代起，发展了各种新的解联立方程组的方法,属计算分光光度法的范畴。计算分光光度法

运用数学、统计学与计算机科学的方法，通过试验设计和数据变换，解析和预测对物质进行定性、定量的方法，属于“化学计量学”的范畴。涉及的数学领域可分为：

数值计算数学变换一、数值计算的数学模型和计算方法

若被测物含n个组分，在m个波长处测定，得含m个n元一次方程组：求解方法

图解法（加减消元法）：

双波长法、系数倍率法、三波长法信号处理法：

卡尔曼（Kalman）滤波法矩阵解法；

（偏）最小二乘法、P矩阵法、主成分回归法、等吸收双波长消去法

双波长法

Aa

测a组分

b

选测量波长λ2、参比波长λ1，选择原则：λ2λ1λ①干扰组分b在λ2和λ1有相同E值

干扰b：②被测组分a在λ2和λ1有较大ΔE值

被测a：双波长法测a组分

Aa选测量波长λ2、bΔA

参比波长λ1，测出混合物的ΔA

λ2λ1λ样品液测a纯品液测

Aa

如何选择测量

bb组分的λ2、λ1？

λ1λ2λ

苯甲酸钠安钠咖样品咖啡因200230257252272300λnm00.50.40.30.20.10.6A安钠咖、苯甲酸、咖啡因吸收曲线A345687911021AAλλλ图12-28几种吸收光谱的组合干扰组分有等吸收点，可用等吸收双波长消去法干扰组分无等吸收点，不可用等吸收双波长消去法

系数倍率法

适用于：干扰组分的吸收光谱无吸收峰或谷，找不到等吸收波长。λ2λ1λAAλ1Aλ2干扰组分y系数倍率法原理—干扰组分影响的消除

x：被测组分Ayx选测量波长λ2、参比波长λ1；且：测纯y液，计算K值，λ1

λ2

λ使K：隐蔽系数测样品，计算：

乘K值时，干扰组分和被测组分在λ2处的信号都放大了K倍，使ΔA值增大，灵敏度提高，但K值以5～7为限，否则因噪声的放大，使信噪比减小而不利于测量。二、数学变换方法

通过数学处理，建立吸收曲线的数学信息与物质的量之间的联系。主要的数学变换法：

导数光谱法正交函数法褶合光谱法导数光谱法

A=CE把该式写成波长的函数

A=Cf（λ）求导得一阶导函数，导函数的图象，叫导数光谱。

A～λ函数图：0阶光谱图函数图：一阶导数光谱图函数图：二阶导数光谱图

……

函数图：n阶导数光谱图导数光谱图作法：①手工计算作图每隔1～2nm，逐点计算

作图，得一阶导数光谱图；按此继续处理，得高一阶导数光谱图……②利用仪器计算机记忆与数据处理功能储存A～λ光谱数据微分数学处理（一般仪器可给出四阶导数光谱）

(1)导数光谱的波型和特点

①

峰在单数阶导数图是

0值偶数阶导数图极值

（利于峰值鉴定）

②拐点在单数阶导数图是极值偶数阶导数图0值

（鉴别肩峰）

③导数阶数增加，极值数目增加极值数=导数阶数+1

（分辨能力增强，鉴别重迭谱带）

高斯谱带的微分零阶一阶二阶三阶四阶

(1)、导数光谱的定量原理：依据：对λ求导：当λ一定，E是定值。也是定值故与C成正比

同理可得：二阶导数三阶导数在任意一波长，导数光谱值与浓度成正比。

(3)导数光谱法对干扰吸收的消除

若：干扰吸收可表达为幂函数求一阶导数后：

则：n次函数的n阶导数为常数；

n次函数在n+1阶导数图中消去。即：干扰背景将随求导阶次的增加而逐步

降幂乃至消失。（4）导数光谱法定量数据的测量

定量依据；

导数光谱很灵敏，波长、谱带宽度、求导条件（Δλ取值、求导的阶次等）对其影响很大，不象E，能求出通用的常数，需要用标准对比法定量。标准对比法（1）选择求导条件（Δλ、求导阶数）（2）配制5个不同浓度的标准溶液，分别测出：图（3）量取某波长处振幅（几何法P265）（4）作振幅高度-浓度标准曲线（或求出直线方程）（5）同样条件下测样品，求C样图12-34导数光谱的求导p、峰-谷法d、正切法z、峰-零法(4)、导数光谱定性和定量分析示例（1）定性鉴别：乙醇中痕量苯的检定一般紫外光谱法：50ppm的苯才能检出导数光谱法：1ppm可检出乙醇中痕量苯的测定醇中含苯1ppm的四阶导数光谱醇中含苯1ppm的二阶导数光谱

醇中含苯10ppm的

醇中含苯1ppm的

空白醇紫外吸收光谱(2)定量分析：废水中苯胺和苯酚同时定量测定含5ppm苯胺和苯酚的四阶导数光谱含5ppm苯胺和苯酚一般光谱五、光电比色法（可见分光光度法）

测定吸收可见光的有色溶液经显色反应变成有色物的溶液

络合反应

显色反应类型氧化还原反应缩合反应

例如：（1）铝或锆测定作为配位体的黄酮类化合物（2）金属离子与两种以上的配位体形成多元络合物（例三元络合物）提高选择性、灵敏度（3）显色中，加入表面活性剂，形成胶束状化合物，提高灵敏度（4）形成离子对的反应（例生物碱与酸性染料形成的离子对）（5）显色后的有机物，若溶于有机溶剂，可萃取后再测定，可排除干扰、提高灵敏度

对显色反应的要求：

（1）显色反应定量（2）反应产物（有色物）稳定（3）有色被测物与试剂颜色差别大（4）有色物的ε足够大（103～105）（5）显色反应有较好的选择性

显色反应能达到上述要求，必须控制反应条件。显色反应条件的控制1、酸度：影响有机酸显色剂的配位反应例：Fe3+与磺基水杨酸根(C7H4O6S)2-反应：

pH1.8~2.5Fe(C7H4O6S)+红褐色

4~8Fe(C7H4O6S)-2褐色

8~11.5Fe(C7H4O6S)3-3黄色

>12Fe(OH)3吸光度随pH变化曲线图适宜酸度范围；

A值相对稳定所对应的酸度范围A

2、显色剂的浓度：

浓度太小，显色反应不完全浓度太大，可能改变显色反应的生成物的组成例：较低时，生成

>0.1mol/L，生成

>0.2mol/L，生成增大，产物颜色逐渐加深吸光度随显色剂用量变化曲线图适宜显色剂用量范围：

A值相对稳定所对应的显色剂用量范围A显色剂用量吸光度随时间变化曲线图适宜时间范围：

A值相对稳定所对应的时间范围A时间3、显色时间显色时间不同，生成物的稳定性不同4、反应温度5、溶剂6、试样中共存组分的干扰

加入合适的掩蔽剂改变干扰组分价态选择合适的显色条件选择不受干扰的测定波长利用参比溶液抵消干扰预先采用萃取，离子交换，柱层析等方法分离干扰组分。

定量方法：

常用标准曲线法紫外-可见分光光度法实验方案的确定1、实验条件的选择：溶剂、显色剂（种类及用量）、

pH、λmax2、稳定性试验：作A-t曲线3、线性范围：作A-C曲线4、回收率试验5、样品测定第一节紫外-可见吸收光谱的

一些基本概念(P235)

（一）跃迁类型分子中不同轨道的价电子具有不同的能量，处于低能级的价电子吸收一定能量后，会跃迁到较高的能级。分子中电子跃迁类型如下：分子中电子跃迁类型：

σσ*π*n能量反键成键反键未成键成键图10-2分子中价电子能级跃迁示意图π1、跃迁

所需能量大，吸收峰一般在远紫外区（λ<200nm)

例：饱和烃类：λmax<150nm2、跃迁

产生：含杂原子的饱和基团（-OH，-NH2，

-X，-S等）

λmax约为200nm

3、跃迁产生：含杂原子的不饱和基团（-C=O，-C=N，-C=S，-N=N-等）一般：λmax=200～400nm，

ε小（10～100）（弱吸收）例：丙酮λmax=279nm，

ε=10～30。4、跃迁产生：不饱和碳氢键孤立跃迁约在200nm

ε>104（强吸收）共轭键越长，跃迁所需能量越小，

λmax越长例：CH2=CH2

λmax=165nmε=104CH2=CH2-CH2=CH2

λmax=217nm

ε=21000

与的差别：（1）、吸收峰强度不同：

ε10~100弱吸收ε>104

强吸收（2）溶剂的极性对这两类跃迁所产生的吸收峰位置的影响不同。溶剂极性增大时：吸收峰向短波方向移动（紫移或短移）吸收峰向长波方向移动（红移或长移）图10-8极性溶剂对两种跃迁能级差的影响非极性溶剂极性溶剂非极性溶剂极性溶剂n<>4、电荷迁移跃迁分子内电荷转移电子给予体电子接受体图10-3电荷迁移跃迁示意图例NR2R1N+R1R2电子接受体电子给予体5、配位场跃迁在配体的配位场作用下，过渡元素的d轨道和镧、锕元素的f轨道分裂，吸收光能后，低能态的d（或f）电子跃迁到高能态的d（或f）轨道上，其ε<102（二）常用述语1、生色团：有机物中含或跃迁的基团。不饱和杂原子基团如：