糖苷酶及其抑制剂的研究

糖苷酶及其克制剂的研究摘要：糖苷酶是生命体正常运转的核心性酶，糖苷酶克制剂可克制糖苷酶的活性，阻断碳水化合物的分解，因此对某些糖代谢紊乱性疾病如糖尿病、肥胖病等有临床应用价值。本文研究了糖苷酶中的β－半乳糖苷酶、β－葡萄糖苷酶以及蔗糖酶的克制剂。重点研究了β－半乳糖苷酶的分子构造和活性基团，并从构造出发筛选其克制剂，发现此酶的克制剂种类较少且克制活性较低。本实验采用混合交叉筛选法筛选了多个金属离子和氨基酸对β－半乳糖苷酶的克制作用，同时也筛选了天然产物和合成化合物。核心词：糖苷酶β－半乳糖苷酶β－葡萄糖苷酶蔗糖酶克制剂的筛选混合交叉法1、前言糖苷酶和糖基转移酶不仅参加了体内碳水化合物的消化，并且是糖脂、糖蛋白生物合成中寡糖链的修剪酶，它对糖蛋白中寡糖链的形成极为重要；糖链的构成与构造是糖蛋白特异生物功效的识别部位，因此糖苷酶活性对糖蛋白生物合成有核心作用，而后者又涉及到免疫反映、神经细胞的分化、肿瘤的转移以及病毒和细菌的感染.因此,糖苷酶不仅是生命体正常运转的核心性酶,同时又是许多疾病的有关酶.与病毒感染、癌症及一系列新陈代谢紊乱性疾病如糖尿病、肥胖病有关。由于糖苷酶重要的生物学意义，糖苷酶克制剂的研究也引发了人们的极大爱好。糖苷酶克制剂即是可克制糖苷酶的活性，阻断碳水化合物的分解，克制淀粉、麦芽糖、蔗糖转变成单糖；影响糖脂、糖蛋白生物合成中寡糖链的修剪；因此糖苷酶克制剂不仅对某些糖代谢紊乱性疾病如糖尿病、肥胖病等有临床应用价值[1]，并且可作为抗AIDS病毒[2]、抗鼠白血病毒[3]的潜在治疗试剂。本论文重点研究了糖苷酶中的β－半乳糖苷酶β－半乳糖苷酶（β－galactosidase）又称β－D－半乳糖苷水解酶，（β－D－galactosid--egalacto-hydrolase,EC.3.2.1.23）,商品名为乳糖酶（Lactase），它广泛存在于豆类及其它多个动植物体内和微生物中。它能够催化β－半乳糖苷化合物中的β－半乳糖苷键发生水解，还含有转半乳糖苷的作用。由于它含有糖苷键构造特异性，可作为乳糖降解和双糖合成催化剂[4,5]，并有水解生物体内储存的多糖和半乳糖残基.引发血型转化等生理功效[6,7]而受到人们广泛关注，成为生物化学和酶催化化学的重要研究课题。β－半乳糖苷酶的应用有着久远的历史，最初在食品工业中用来降解乳糖含量以满足乳糖不适症患者的需要，然而随着生物技术的发展，它越来越应用于基因工程、蛋白质工程和疾病诊疗方面。将β-半乳糖苷酶与人体胞外淀粉状蛋白前体融合形成融合蛋白,可作为Alzheimer病的免疫源,并进一步制备其单克隆抗体[8]。尚有报道将β-半乳糖苷酶作为一种辅蛋白,用作猫白血病毒gp70的疫苗[9]。在诊疗方面,将抗菌性HIV病毒基因与β-半乳糖苷酶基因LacZ重组后作为定量HIV运用循环的早期克制作用,并预测化合物抗HIV的活性工具。同时，近年来β－半乳糖苷酶基因被越来越频繁的用于转基因治疗方面，β－半乳糖苷酶基因作为报告基因，通过检测β－半乳糖苷酶的体现状况，研究转基因治疗[10]。在环境检测方面,大肠杆菌的β-半乳糖苷酶活性检测可快速分析浴场和渔场地区水体受排泄物污染程度。由于β－半乳糖苷酶的广泛应用和重要的临床价值，人们对此酶的基因进行了进一步的研究，通过众多学者的努力，现在β－半乳糖苷酶基因库已基本建立并将日趋完善。但是，对于此酶的克制剂研究还极少，现在文献中所报道的研究酶和克制剂互相作用的办法，基本上是用单一的竞争性或非竞争性克制剂与酶作用，通过动力学研究或用当代仪器分析技术进行表征，获得有关酶的构造或催化机制的信息。本实验就从酶的构造出发，探讨研究并大量筛选其克制剂。Overallviewsoftheβ-galactosidaseactivesiteFigure1.Stereoviewofasurfacerepresentationofthetetramerinwhicheachsubunitisshowninadifferentcolor.Twolactosemolecules(showninwhite)areshownbindingintheactivesitepockets.Thedeepestpartsoftheactivesitesarenotvisibleinthefigure.Theothertwoactivesitesareonthe“back”sideofthetetramer.Figure2.Closerstereoviewofasingleactivesite.Proteinatomsarecoloredbydomainwithdomain1inblue,domain2incyan,domain3inyellow,anddomain5inred(therearenoatomsfromdomain4).Solventmoleculesandmetalsareinwhite.Theyellowballsaremetalligandswhichareproteinatoms.ThesemitransparentsurfacewascalculatedusingproteinatomsplussolventatomswithB<25?2.Twoligandsareshown:lactose(green)bindsinthe“shallow”modewhilegalactono-lactone(red)bindsinthe“deeper”mode.通过对酶的分子构造和活性基团的分析，发现其蛋白质原子中有金属配体，因此研究了金属离子和氨基酸对此酶的克制活性。2.实验部分1、混合交叉法筛选金属离子和氨基酸等生物小分子cooperationeffectofAminoacidsandMetalsMixtureofAminoacidsRelativeactivity(%)MixtureofMetalsAlaCoCysNiSerBLysCdPhe101ZnHis100MnLeuCuTrpMg从上表能够看出，金属离子和氨基酸有协同克制活性，但克制效果较小，当单独的金属离子有激活作用时（如Mg），协同多个氨基酸反而体现有克制活性，能够初步判断比较好的是Co和Ala的协同效果。2、天然产物化合物的筛选涉及黄酮类、异黄酮类、染料木素及其铜、锌、硼络合物、酰化物、多酚类、联苯类等一系列化合物。Table2.TheTheinhibitionofnaturecompound单位：mMCompoundIC50和厚朴酚厚朴酚－染料木素－茶多酚槲皮素－小檗碱－黄芩苷－半乳糖曲克卢丁－铜络合Genistein－锌络合Genistein－改造厚朴酚－改造和厚朴酚－3、合成化合物的筛选通过筛选发现，奎啉类衍生物对β－半乳糖苷酶含有一定的克制活性。Table3.Theinhibitionofsynthesiscompounds单位：mMCompoundIC503.成果与讨论通过上述多个金属离子、氨基酸以及天然产物和合成化合物的大量筛选，我们得出一定的酶与克制剂的构效关系讨论：1、二环或三环多酚类化合物对该酶有克制效果2、三环类黄酮化合物的C环若为刚性的苯环则没有克制效果。3、喹啉衍生物中取代基中含有较大原子的化合物克制效果更加好4、喹啉衍生物中取代基含有氨基支链的克制效果较好在研究β－半乳糖苷酶的同时也研究了糖苷酶中的β－葡萄糖苷酶和α－蔗糖酶，对它们的克制剂也进行了筛选，发现下面三种化合物同时对β－半乳糖苷酶、β－葡萄糖苷酶有克制活性。对三种糖苷酶克制剂的筛选我们得出下列结论：1.β－半乳糖苷酶、β－葡萄糖苷酶、α－蔗糖酶的潜在克制剂的高效克制较少