地黄寡糖对脂肪细胞增殖和胰岛素抵抗的影响

地黄寡糖对脂肪细胞增殖和胰岛素抵抗的影响

地黄是一种传统的中医，已经在中国治疗糖尿病已有几千年的历史。地黄寡糖(ROS)是地黄的主要成分之一,具有改善造血、促进免疫、抗肿瘤等作用。体内实验证明ROS无论以腹腔注射或灌胃均可降低四氧嘧啶(ALX)糖尿病大鼠的血糖,对去胸腺大鼠及老年大鼠受损的糖代谢有改善作用。由于成人糖尿病以2型糖尿病为主(占90%以上),胰岛素抵抗为2型糖尿病病理生理学的中心环节,作者采用地塞米松诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗细胞模型,研究地黄寡糖对脂肪细胞增殖及胰岛素抵抗的药理作用。1材料和方法1.1试剂和仪器地黄寡糖(兰州军区兰州总医院全军临床药理基地提供,其中四聚糖占60%,三糖占20%,其余为单糖或二糖);3T3-L1前脂肪细胞购自中国医学科学院基础研究所;地塞米松(Des)(批号123K11611),胰岛素(Ins)(批号024K0988),3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(批号034K3734),含酚红DMEM高糖培养基(批号123K83031),无酚红DMEM高糖培养基(批号074K8300),上述试剂均购自Sigma公司;MTT(批号1313B11)购自aMResco公司;优级新生小牛血清(批号20031219)购自兰州民海生物工程有限公司;油红O(批号830120)购自上海化学试剂分装厂(Chroma进口分装);马来酸罗格列酮片购自葛兰素史克(天津)有限公司(批号04060055);葡萄糖临床检测试剂盒,购自四川迈克公司(批号0305011)。1.2方法1.2.1%co饱和和湿度下培养参考AnilKumarK.L.分化前脂肪细胞的方法,对细胞进行分化:将3T3-L1前脂肪细胞置于含10%小牛血清的DMEM高糖培养基中,37℃,5%CO2饱和湿度下培养。细胞状态良好时接种于培养板,待细胞融合2d后,加含0.5mmol.L-13-异丁基-1-甲基黄嘌呤,0.25μmol·L-1地塞米松,10μg·mL-1胰岛素,10%小牛血清的DMEM高糖培养基培养48h,换以含10μg·mL-1胰岛素的培养基再培养48h,随后以10%小牛血清的DMEM高糖培养基继续培养,2d换培养液1次,诱导分化8～12d的3T3-L1细胞,90%以上呈脂肪细胞表型可用于试验。1.2.2细胞不同固定移去诱导分化结束细胞的培养基,用PBS洗3次,用10%甲醛室温下固定细胞1h,弃去固定液,PBS洗3次,然后将细胞晾干20min;加入油红O溶液,室温下染色2h,弃去染色剂,用异丙醇洗去未着色的染料,然后用苏木精复染细胞核倒置显微下观察、照相。1.2.3不同处理对3-l1前脂肪细胞增殖的影响当接种于96孔板的3T3-L1前脂肪细胞及脂肪细胞达到约80%融合时,换以含不同浓度地黄寡糖的培养基孵育48h,用葡萄糖临床检测试剂盒测定培养基上清液中的葡萄糖含量,计算每组细胞的葡萄糖消耗量,然后每孔加入MTT(5mg·mL-1)10μL继续孵育4h,将培养基倒尽,吸干,每孔加入二甲基亚砜200μL,混匀后置酶标仪570nm处测定吸光度,观察地黄寡糖对3T3-L1前脂肪细胞和脂肪细胞增殖的影响。1.2.4胰岛素抗性对分化好的细胞分组进行处理,加1μmol·L-1地塞米松诱导胰岛素抵抗,每2天换1次液,取上清液,以培养基中的葡萄糖的消耗量反映胰岛素抵抗的程度。葡萄糖含量用葡萄糖检测试剂盒测定。在胰岛素抗性成立以后,设空白对照组、地塞米松模型组、阳性对照组(罗格列酮,终含量为3.4μg·mL-1),ROS处理组,终含量分别为0.1,0.3,1,3,10,30μg·mL-1。上述各组分别不加胰岛素处理和加胰岛素(10μmol·L-1)处理。分别在药物处理24,48,72,96h后检测培养基中葡萄糖含量。1.3统计处理各组实验数据均用x¯±sx¯±s表示,采用SPSS10.0软件进行统计学处理,组间差异的显著性检验用t检验。2结果2.13细胞诱导分化诱导分化前的3T3-L1脂肪细胞呈典型的梭形,胞浆中无脂滴,形态与成纤维细胞相似(图1,2)。当细胞完全汇合后,处于生长停滞,在多个视野下均未见处于明显分裂相的细胞,诱导分化第4天时,细胞变大、变圆,细胞中有脂滴出现,用油红O染色后脂滴着红色,细胞核着蓝色。诱导分化第8天时,有较多的细胞出现双核;诱导分化第12天时,90%的3T3-L1前脂肪细胞都分化为成熟的脂肪细胞,表现为细胞浆丰富,含有大量的脂滴,脂滴分布于核周围,形成“戒环样”结构,为典型的成熟脂肪细胞形态,能观察到许多富含脂滴的脂肪细胞正在分裂成为2个细胞,油红染色后脂滴着红色,细胞核着蓝色(图3,4)。2.2罗格列酮对3gs-l前脂肪细胞增殖的抑制作用无论胰岛素存在与否,地黄寡糖对3T3-L1前脂肪细胞均具有促进增殖作用,地黄寡糖对3T3-L1脂肪细胞的增殖均具有抑制作用,在0.1～30μg·mL-1呈明显的量效关系。罗格列酮(3.4μg·mL-1)对3T3-L1前脂肪细胞增殖呈抑制作用,与地黄寡糖(3.0μg·mL-1)作用相反;罗格列酮(3.4μg·mL-1)在不含胰岛素时对3T3-L1脂肪细胞增殖具有抑制作用,罗格列酮(3.4μg·mL-1)在含胰岛素时对3T3-L1脂肪细胞增殖具有促进作用(表1)。2.3对葡萄糖的作用对于3T3-L1前脂肪细胞,罗格列酮只有在胰岛素存在下才显示较好的促进葡萄糖消耗利用功能。地黄寡糖在不含胰岛素时即有较好的促进葡萄糖利用的作用,在0.1～30μg·mL-1呈良好的量效关系;地黄寡糖在胰岛素存在时亦有较好的促进葡萄糖消耗的作用,但不如罗格列酮明显,此结果显示地黄寡糖的作用与罗格列酮完全不同。无论胰岛素存在与否,地黄寡糖对3T3-L1脂肪细胞,均有促进葡萄糖消耗的作用,而罗格列酮仅在胰岛素存在时具有促进葡萄糖消耗的作用(表2)。2.4对各组培养基内葡萄糖浓度的影响在地塞米松作用下,模型组对胰岛素的敏感性降低,对培养基中葡萄糖的摄取减少,说明造模成功(与空白组比较P<0.001)。加药处理24,48,72,96h后分别测定各组培养基中的葡萄糖浓度,罗格列酮组与地黄寡糖各剂量组均较胰岛素抵抗模型组有降低,且随着时间的变化各组培养基中的葡萄糖浓度逐渐降低,地黄寡糖不加胰岛素处理组在72h与96h时0.1～30μg·mL-1呈良好的量效关系(与地塞米松模型组比较P<0.001);地黄寡糖加胰岛素处理组在96h时0.1～30μg·mL-1呈良好的量效关系(与地塞米松模型组比较P<0.001),其最佳剂量为10μg·mL-1,且地黄寡糖加胰岛素组的作用与罗格列酮非常接近(表3)。3实验结果分析胰岛素抵抗为2型糖尿病发病的中心环节,尚未找到有效的控制措施。本实验采用体外胰岛素抵抗细胞模型研究了地黄寡糖(ROS)对脂肪细胞增殖及胰岛素抵抗的作用。中药地黄为治疗糖尿病的四大“圣药”之一,在糖尿病治疗方面具有悠久的历史。本课题组以往研究发现从地黄中提取的地黄寡糖对实验性糖尿病大鼠模型与生理性高血糖均有调节作用。本实验选用了3T3-L1脂肪细胞作为体外研究载体,实验结果表明地黄寡糖作用于地塞米松诱导的胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞,明显降低了细胞培养基中的葡萄糖含量,其作用与胰岛素增敏剂罗格列酮相似,这说明地黄寡糖具有改善3T3-L1脂肪细胞的胰岛素抵抗状态,增强脂肪细胞对葡萄糖摄取和利用的能力,从体外细胞水平上说明地黄寡糖具有改善胰岛素抵抗的作用。但同时地黄寡糖抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化,促进前脂肪细胞的增殖,抑制脂肪细胞的增殖,增强前脂肪细胞与脂肪细胞对葡萄糖摄取和利用,这些效应又完全不同于罗格列酮,这提示地黄寡糖在增加细胞葡萄糖摄取的同时