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卷柏属药用植物鉴别及亲缘关系分析

柏树属植物属于蕨类植物门石松科。这是一种多年生草本植物。在世界上大约有700种。在中国,分布了60-70多个地区,其中22种具有药用价值。现代药理研究表明:卷柏属药用植物不仅具有传统的清热解毒作用,还具有抗肿瘤、降血糖、抗病毒、止血、免疫调节等多种功能。由于该属某些植物的形态较为类似,鉴别时容易引起混淆。近年来分子标记技术被引入中药鉴定研究,以与形态组织学和化学分析方法得到的结果进行验证。其中RAPD分析是一种有效的DNA分子标记方法,对亲缘关系分析有良好效果。因此,本文在用形态、组织和化学方法进行鉴定研究的基础上,对8种卷柏属药用植物进行分子标记研究,探索彼此间的亲缘关系和遗传距离,了解其变异程度,为卷柏属药用植物的鉴定和资源合理开发提供参考依据。1材料和试剂1.1新鲜叶片的采集和干燥实验材料样品的采集地点和时间见表1,每份样品采集6~10株植物的新鲜叶片,用硅胶快速干燥保存。样品的植物学名由万定荣教授鉴定,采集的标本留存于湖北中医学院标本室。1.2pcr扩增检测仪器:TGL-16G型高速离心机(上海安亭科学仪器厂):DYY-6B型电泳仪(北京市六一仪器厂):GENEAMP5700PCR扩增仪(APPLIEDBIOSYSTEMS,美国);MGIAS-1000D多媒体凝胶成像分析系统。试剂:琼脂糖(Promega公司);SYBR-Greenl(达科为生物技术有限公司);随机扩增引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs、Marker(100bp-3000bp)、CTAB(上海Sangon公司);Tris(Amresco)。2方法和结果2.1相关乙醇的提取取干叶片约50mg,置1.5mlEp管中,加入液氮研碎,立即加入500μl预热至56℃的2×CTAB提取缓冲液[CTAB2%,Tris-HCl(pH8.0)100mmol/L,EDTA20mmol/L,NaCl1.4mol/L,巯基乙醇2%]及巯基乙醇20μl混匀,56℃水浴保温30min,其间轻微翻动浮板三次;加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)抽提,轻轻颠倒混匀,12000r/min离心10min,吸取上清液,加入0.1倍的10%CTAB溶液,室温下放置10min,再用氯仿-异戊醇(24∶1)抽提一次;取上清液加入等体积的1×CTAB沉淀缓冲液[CTAB1%,Tris-HCl(pH8.0)50mmol/L,EDTA10mmol/L,巯基乙醇1%],室温下放置3h;12000r/min离心30min,小心去掉上清液,分别用65%乙醇和85%乙醇各洗涤2次,然后于60℃烘箱中干燥30min。加入TE缓冲液溶解DNA,存于-20℃冰箱备用。2.2pcr检测dntp、taq酶、dna模板反应体系:总体积为25μl,其中10×PCRbuffer2.5μl,Mg2+(20mmol/L)1.9μl,引物(20μmol/μL)1μl,dNTP(10mmol/L)0.5μl,Taq酶(5U/μl)0.3μl,DNA模板(50ng/μl)0.5μl,ddH2O18.3μl。扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性45s,36℃退火1min,72℃延伸1.5min,40个循环,72℃后延伸5min。扩增产物加入1%的荧光染料SYBER-Greenl于2%琼脂糖凝胶上用1×TAE缓冲液电泳,在凝胶成像分析系统上观察并拍照。2.3强、重复性引物从60个10bp随机引物中,筛选出扩增性强、重复性好、多态性明显的8个引物,用于全部卷柏属样品基因组DNA的扩增。所用引物序列见表2。图1、2为卷柏样品的两个扩增图谱。2.4相似系数的计算对每一个样品根据在凝胶上同一位置所扩增的DNA条带的有或无分别标记为1或0(条带存在为1,条带不存在为0),在相同条件下,迁移相同的条带视为同源位点,统计的二元数据用SPSS11.5分析软件中的Jaccard方法计算样品间的相似系数,用Withingroupslinkage聚类方法分析,得到各样品的亲缘关系树系图(图3)。8个引物共扩增出58个条带,见表2,扩增产物多集中在100~1500bp。3讨论3.1高盐低ph值法提取方法的确定在提取总DNA时,比较了文献介绍的CTAB法与高盐低pH值法,发现CTAB法对新鲜样品的提取效果优于高盐低pH值法。最终选择了改良CTAB法,操作简便,易于提取,扩增条带较清晰。在提取时,抽提液一般使用苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1),但实验中发现不用酚也能完全达到要求,含有酚的话反而会因其残留问题影响后面的实验过程,故抽提液选择为氯仿-异戊醇(24∶1)。3.2传统分类方法分析聚类分析表明:8种卷柏属植物有较明显的分界,其中薄叶卷柏与疏叶卷柏,伏地卷柏与异穗卷柏,小翠云与翠云草两两之间的遗传关系较近,分别聚为一类,这些分析结果具有一定合理性,其中最明显的是小翠云与翠云草样品的空间距离虽然最远,但分析表明遗传距离很近,聚为一类,与实际情况和传统分类方法完全一致。细叶卷柏、江南卷柏与薄叶卷柏分别是三种具有显著疗效的药用植物,它们的形态极为相似而易于混淆。其中,细叶卷柏多生于高海拔地区,江南卷柏生于一般丘陵山坡,而薄叶卷柏多生于丘陵河谷或潮湿地区。分析结果表明,这三个种分别为较独立的类群,它们之间既具有显著的遗传差异,但遗传距离又比较接近,与实际情况相符。3.3遗传聚类分析从实验结果及聚类分析图可发现,相同产地的同一种样品的RAPD图谱基本一致。同一产地(鹤峰卷柏,10、11号样品)的疏叶卷柏首先聚类,然后与恩施产疏叶卷柏(12号样品)聚类,再与产地相对较远的宜昌产疏叶卷柏(13号样品)汇聚,说明疏叶卷柏样品的地理分布越远,其遗传差距越明显。在同种植物中,异穗卷柏和薄叶卷柏有2份样品与主分类群出现了游离,正好反映了种下变异。其中样品5为仅有独立孢子枝的异穗卷柏,样品4则为兼具营养枝和孢子枝的异穗卷柏(孢子叶尚未长出),尽管它们为同一个种,但并没有简单地聚为一类,提示两者在所含遗传信息上有所差异;样品2和4聚为一类,样品1和3在近距离另聚为一类,我们发现这些样品在形态上就有所不同,样品2和4孢子叶尚未长出,而样品1和3有孢子枝。两个薄叶卷柏样品没有完全聚为一类,也说明二者在遗传基础上有所差异,这一结果同样支持将变异类型的薄叶卷柏作变种处理,与用形态学方法获得的结果基本吻合。以上,本属8种植物17份样品的RAPD研究及聚类分析结果表明,RAPD技术能较好地用于分析卷柏属植物种间或种下样品的遗传距离,能灵敏地揭示两个关系相近的个体之间的遗传差异,适合解决种下等级鉴定等问题。同时,由遗传距离获得的有关药用植物间的亲缘关

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