高黎贡山白花岭地区淀粉水解透明圈的筛选

高黎贡山白花岭地区淀粉水解透明圈的筛选

淀粉酶（amylae）广泛存在于动植物和微生物中。这是解粘液和糖原酶的总称。这是第一种用于工业生产、用途最广泛、产量最高的酶制剂品种p1-5。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造P33-34、果汁和食品加工P76-78、医药、洗涤剂P30-35、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂P33-34等多种领域。由于淀粉酶具有重要的商业价值,致使很多研究者积极寻找产生该酶的新菌株,或者利用生物工程的方法寻找该酶的基因,改造菌株P1131-1133,使淀粉酶的产量提高数倍或数十倍,并已应用于工业生产,给选育高产淀粉酶提供了新的途径。近年来,国内的酶制剂工业蓬勃发展,品种和产量也不断在增加,但是同国外酶制剂行业还有一定的差距,并且我国淀粉酶剂型、品种和生产菌种都比较单一P51-52。由于我国淀粉资源相对比较丰富,淀粉应用范围比较广泛,因此淀粉酶工业发展必将促进我国其他工业的迅速发展,为适应国民经济发展的需要,应进一步扩大淀粉酶的产量和品种,这有助于发现新的淀粉酶来适应新的工业需求P3-5。为此,本文从高黎贡山百花岭不同海拔的土壤样品中筛选一批产淀粉酶的株菌,为进一步研究淀粉酶的酶活性、产酶条件优化等相关性质奠定一定的基础。1.材料和方法1.1材料表面1.1.1土壤土壤样品采自高黎贡山百花岭海拔1500-1600m之间的区域,取5-20cm深处土样装入纸袋,作好记录。1.1.2制备工艺1)牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌用):琼脂20g,牛肉膏3.0g,蛋白胨10g,NaCl5.0g,蒸馏水1000ml,pH7.0-7.2,121.3℃灭菌20min。2)淀粉酶选择培养基(采用改进的LB培养基+1.0%可溶性淀粉):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl5.0g,可溶性淀粉10g,琼脂20g,蒸馏水1000ml,pH7.8。1.1.3主试剂培养基成分为市售分析纯和生化试剂。1.1.4压力蒸汽灭菌器DHP-9082型电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司),LDZX-75KB型立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂),SW-CJ-1F型超净工作台(苏州安泰空气技术有限司),CP214电子天平(奥豪斯仪器上海有限公司制造),200B华菱冰箱,气浴恒温振荡器,微波炉。1.2方法1.2.1菌悬液的采集将采集的样品用蒸馏水分别稀释10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍配制成菌悬液,分别取50μl的菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板培养基上,用玻璃棒将其在平板上涂布均匀,然后置于30℃恒温箱中培养。2)平板划线培养用接种针从涂布均匀的平板中挑取外观形态、大小、颜色各不相同的菌落,继续在牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线接种,置于30℃恒温箱中培养24h~48h,直至产生单个菌落。1.2.2淀粉淀粉酶试验将各种不同的单菌落分别标号后,接于淀粉酶选择培养基上进行培养,并将其对应标号,放入30℃培养箱中培养24h-48h。取出上述培养好的平皿,在长出的菌落上滴加碘液,菌落周围如有无色透明圈出现,说明淀粉被水解,即该菌株能产生淀粉酶。挑选有明显透明圈的单菌落再转接到淀粉酶选择培养基上进行扩大培养(利用接种针挑取并点接于培养基),经碘液染色后根据“水解圈直径/菌落直径”的大小值,筛选出产淀粉酶菌株。2.产淀粉酶菌株的水解圈我们从高黎贡山百花岭海拔1500-1600m之间的区域土壤中采集土样,筛选产淀粉酶的菌株。结果得到23株产淀粉酶的菌株,这23株菌株在含有淀粉的筛选平板上产生明显的淀粉水解透明圈,如图1所示。分别把23株菌株编号为CM1~CM23,其水解圈直径D2与菌落直径D1的比值如表1所示。菌株产生水解圈的情况如图1所示。从表1可知,23株产淀粉酶的菌株所形成的透明圈直径与它们的菌落直径之比大多数在1.9到4.5之间;个别菌株该值比较大,比如CM3、CM7、CM9、CM16、CM23,它们的透明圈直径与菌落直径之比分别达5.5,5.2,5.5,5.0,5.0。透明圈直径与菌落直径之比可作为判断菌株产酶能力大小的初步指标。3.淀粉酶产生菌的筛选及初步鉴定通过对高黎贡山采集的土样进行稀释分离、接种选择、鉴定,并根据淀粉遇碘变蓝的特性,在淀粉选择培养基上培养的单菌落加碘液后菌落周围出现了透明圈,成功筛选鉴定出23株具有产淀粉能力的产生菌,同时对水解圈直径和菌落直径