基于abps和sw485肿瘤抗原的树突状细胞联合cik细胞对结肠癌细胞杀伤活性的影响

基于abps和sw485肿瘤抗原的树突状细胞联合cik细胞对结肠癌细胞杀伤活性的影响

牛膝是一种传统的中医。中医认为，牛膝具有益肝肾、强筋骨、清火解毒、活血化瘀的功效。牛膝多糖(A.bidentatapolysaccharides,ABPS)是从牛膝的干燥根中提取的一种化学本质是小分子多糖的活性成分。近年来有研究认为,牛膝多糖具有调节机体免疫力及抗肿瘤的功能。树突状细胞(dendriticcell,DC)是讫今所知的体内抗原递呈功能最强的一种抗原递呈细胞(antigenpresentingcells,APC),是人体特异性免疫应答的始动者。成熟DC高表达HLAⅠ/Ⅱ类分子和CD86,CD80,CD54,CD40等分子,具有很强的递呈抗原及启动免疫应答的能力,在激发机体主动性抗肿瘤免疫中起到很强的作用。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinducedkillers,CIK)是由抗CD3单抗、IFN-γ及IL-2等在体外刺激外周血单个核细胞而诱生的非特异性细胞毒性细胞。CIK细胞是肿瘤过继免疫治疗的主要效应细胞。本实验研究中,通过牛膝多糖刺激和/或SW480肿瘤抗原致敏的DC与CIK细胞联合,作为效应细胞,观察其对结肠癌细胞株SW480的抗肿瘤作用效果,探索天然药物干预的肿瘤过继免疫治疗的可能途径。1材料表面1.1细胞植物健康人外周血细胞随机样本(台州学院医学院09临床专业学生健康志愿者);人结肠癌细胞株SW480(浙江大学医学部免疫所)。1.2elisa试验牛膝根购自临海方一仁药店;Ficoll分离液(美国GE);RPMI1640培养液(美国CORNING);胎牛血清(澳洲Hyclone);rhGM-CSF,rhIL-2(北京四环生物);rhIFN-γ(上海克隆生物);rhIL-4(上海庄衡生物);抗CD3单抗(美国BioLegend);CD80-PE,HLA-DR-FITC,CD86-FITC,CD40-FITC单抗(美国BD);ELISA试剂盒(检测IL-2,IL-12,IL-17,IFN-γ)(美国R&D);CCK-8试剂盒(Yeasen);蛋白检测试剂盒(美国BD)。1.3超声破碎法remist流式细胞仪(美国BD);全自动酶标仪(Bio-Tek);高速调温水平离心机(美国Thermo);超声破碎仪;细胞培养箱(FormaScientific);倒置显微镜(Olympus);超低温冰箱(ThermoForma)。2cd和cik细胞的诱导和培养2.1牛膝多糖的制备把牛膝根研磨成粉末状,取20g加入80%乙醇200mL,加热回流2次各1h,取滤渣挥发乙醇后,用40倍双蒸水分3次回流提取滤液,合并、浓缩。加乙醇搅拌,离心分离沉淀,重复3次。用少量双蒸水溶解沉淀,加等体积氯仿/正丁醇混和液,充分震荡、静置,取上清,重复3次以去除蛋白质。加3倍乙醇醇析沉淀,乙醚、丙酮反复洗涤沉淀,得牛膝多糖固体,浓硫酸真空干燥器内干燥3d至恒重,得率16.53%。苯酚-硫酸法测定牛膝多糖含量为34.17%。2.2SW480肿瘤抗原的制备收集37℃,5%CO2培养48h的SW480细胞,细胞计数,用Hanks液悬浮定容,45,58℃各水浴1h,-78℃与室温交替冻融3次,低温下用超声破碎仪破碎,12000r·min-1离心25min,取上清液测定抗原蛋白浓度,后续实验中SW480肿瘤抗原蛋白的作用浓度均调整至肿瘤抗原蛋白相对应的SW480细胞数目与DC数目的比率为2∶1。2.3DC的诱导和培养取25mL肝素抗凝人外周血用等量Hanks液稀释。用Ficoll分离液密度梯度离心分离、吸取富含外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC)的白膜层;再用Hanks液洗涤,用Tris.NH4Cl破除残留的少量红细胞,离心、洗涤后用含10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养液铺板培养,37℃,5%CO2培养2h,吸出未贴壁的单个核细胞用作CIK细胞的培养;贴壁的单个核细胞用DC完全培养液(含10%FCS的RPMI1640加入rhGM-CSF50μg·L-1,rhIL-410μg·L-1)悬浮调整细胞浓度为5×106个/mL,在6孔培养板中每孔2mL,37℃,5%CO2培养,每3d换液1次,诱导培养DC。2.4CIK细胞的诱导和培养在前述含未贴壁细胞的RPMI1640培养液中加入rhIFN-γ1000U·mL-1,24h后再添加抗CD3单抗50μg·L-1,rhIL-2200U·mL-1。每3d换液1次(含相同浓度的抗CD3单抗和rhIL-2);37℃,5%CO2诱导培养CIK细胞。2.5牛膝多糖和/或SW480肿瘤抗原刺激DC及DC表型的测定将培养至第7天的DC分成下列4个组合进行刺激:①单纯DC组作为对照组;②牛膝多糖刺激DC实验组(牛膝多糖刺激的质量浓度为50mg·L-1);③SW480肿瘤抗原刺激DC实验组;④牛膝多糖(质量浓度为50mg·L-1)和SW480肿瘤抗原联合刺激DC实验组。继续培养2d后,收获DC,用流式细胞仪检测DC细胞表面分子CD80,CD86,CD11c,CD40,HLA-DR的阳性率,比较对照组及各实验组DC表面上述分子表达的差异(对照组及各实验组每组均为6例样本)。2.6DC和/或CIK细胞杀伤活性试验将培养至第7天的DC重新用牛膝多糖和/或SW480肿瘤抗原重复上述4个实验组合进行刺激,继续培养2d后,以上述4个组合的DC与CIK细胞共同作为效应细胞,DC与CIK细胞的比例为1∶5;以SW480细胞株为靶细胞,设置效靶比分别为30∶1,20∶1及10∶1,分别进行细胞杀伤活性试验,用CCK-8试剂盒检测各实验组的细胞杀伤活性,比较各实验组细胞杀伤活性的差异(每组6例样本)。2.7细胞杀伤活性试验中细胞因子分泌水平的测定在上述细胞杀伤活性试验中的4个组合中,选择对SW480细胞株杀伤活性最强的效靶比实验组的上清液,ELISA检测各反应孔(每样本3个复孔)上清液中细胞因子IL-2,IL-12p70,IL-17及TNF-α的分泌水平,比较各实验组及不同效靶比时上述细胞因子分泌水平的差异(每组6例样本)。2.8统计方法实验结果用ˉx±s表示,用SPSS18.0软件进行t检验分析,P<0.05为差异具有统计学意义。3结果3.1树突状突变体的观察用贴壁的PBMC培养的DC数量增加的同时,在培养第3天细胞表面逐渐长出树突状突起,并逐渐增加、伸长,至第7天倒置显微镜下观察为典型的成熟DC的外形。用悬浮的PBMC培养的CIK细胞数量不断增加,至第7天,形成一个个细胞集落,细胞外形变得不规则,细胞体积变大。3.2abps、c7和hla-dr的表达流式细胞仪测定经牛膝多糖和/或SW480肿瘤抗原冲击2d后DC表面分子CD80,CD86,CD11c,CD40,HLA-DR的阳性率,见表1。ABPS刺激的DC细胞组及SW480肿瘤抗原刺激的DC细胞组的表面分子CD80,CD86,CD11c,CD40,HLA-DR的阳性率高于单纯DC细胞组(P<0.05);ABPS和SW480肿瘤抗原共同刺激的DC细胞组表面分子CD80,CD11c,HLA-DR的阳性率高于其他实验组DC(P<0.05),与ABPS刺激的DC细胞组及SW480肿瘤抗原刺激的DC细胞组的表面分子CD86,CD40的阳性率比较,差异无统计学意义。3.3sw400的杀菌效应ABPS+SW480抗原+DC+CIK细胞组在效靶比分别为10∶1,20∶1,30∶1时,对结肠癌细胞株SW480的杀伤活性均高于DC+CIK细胞组、ABPS+DC+CIK细胞组、SW480抗原+DC+CIK细胞组,差异具有统计学意义(P<0.05),见表2。3.4各因子表达的水平根据上述细胞杀伤活性试验的结果,ELISA检测效靶比为30∶1的每个实验组各反应孔(每样本3个复孔)上清液中细胞因子IL-2,IL-12p70,IL-17及TNF-α的分泌水平,见表3。在效靶比为30∶1的细胞杀伤活性试验中,ABPS+SW480抗原+DC+CIK细胞组反应上清液中细胞因子IL-12p70,TNF-α的分泌水平高于其他实验组(P<0.05);与其他实验组比较,IL-2,IL-17的分泌水平无显著差异,且IL-17的分泌水平均较低。4abps对dc细胞毒性和il-17的影响本实验通过ABPS与DC和CIK细胞联合对结肠癌细胞株SW480的杀伤作用的研究,探索中药干预的肿瘤过继免疫治疗的疗效。研究发现,ABPS+SW480抗原+DC+CIK细胞组在效靶比分别为10∶1,20∶1,30∶1时,对结肠癌细胞株SW480的杀伤活性均显著高于DC+CIK细胞组、ABPS+DC+CIK细胞组、SW480抗原+DC+CIK细胞组。说明ABPS与SW480肿瘤抗原协同刺激DC和CIK细胞,能明显增强杀伤SW480细胞株的活性。冯婷等发现ABPS能促进小鼠来源骨髓来源的DC分化和成熟,DC表面CD86和CD11c的表达明显增加,并且能增强小鼠CTL对EC9706细胞的杀伤活性。本研究显示,ABPS刺激的DC细胞表面CD80,CD86,CD11c,CD40,HLA-DR的阳性率高于单纯DC细胞(P<0.05);ABPS和SW480肿瘤抗原共同刺激的DC细胞的表面CD80,CD11c,HLA-DR的阳性率高于其他实验组DC(P<0.05),但表面CD86,CD40的阳性率与ABPS刺激的DC细胞或SW480肿瘤抗原刺激的DC细胞比较,差异无统计学意义。说明ABPS能促进DC的分化和成熟,ABPS和SW480肿瘤抗原共同刺激DC,更能刺激DC的分化与成熟,这说明ABPS和SW480肿瘤抗原在刺激DC的分化与成熟时,两者具有一定的协同作用。宁勇等研究发现,ABPS能增强外周血来源的单核细胞的吞噬功能,且能明显促进单核细胞分泌IL-6和TNF-α2种细胞因子。Robin等发现IL-12能促进NK细胞分泌IFN-γ及增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。本研究发现,在效靶比为30∶1的ABPS和SW480抗原共刺激的DC+CIK细胞对SW40细胞株的杀伤反应上清液中IL-12p70,TNF-α的分泌水平高于其他实验组(P<0.05);IL-2,IL-17的分泌水平与其他实验组之间无显著差异,且IL-17的分泌水平均较低。Bonanno等证实,IL-2和IFN-γ能促进CIK细胞的成熟,增强CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。撒亚莲等将人骨髓来源干细胞与同种异体的DC-CIK细胞共培养,结果发现IL-2与TNF-α的分泌明显增加,而且DC-CIK细胞的免疫功能也明显增强。本研究发现,ABPS能促进DC+CIK细胞TNF-α的分泌,并增强DC+CIK细胞对SW480细胞株的杀伤活性;但是ABPS的刺激对DC+CIK细胞的IL-2的分泌水平无显著影响。IL-17是Th17细胞的具有标志性的细胞因子,它是一种促炎性因子,能促进前炎性细胞因子的释放,进而放大炎症反应。目前已发现在中性粒细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞等细胞中也有IL-17的表达。Martin等发现IL-17通过刺激DC等其他免疫细胞的扩增,以招募肿瘤特异性CTL而达到杀伤肿瘤细胞的目的。本实验研究发现,APBS和/或SW480肿瘤抗原的刺激对DC+CIK细胞IL-17的分泌水平无显著影响。Claudia等研究发现,通过自体DC瘤苗回输治疗的黑色素瘤患者