结核患者外周血中cd4

结核患者外周血中cd4

淋巴结是一种慢性感染疾病。世界上有20亿人感染结核菌，活动骨细胞培养量为1500万。每年新的感染病例为800.100万，180万人因病变死亡。我国是全球22个结核病高负担国家之一,每年新发结核病例130万,死亡数位居我国所有传染病首位。结核菌对机体的长期慢性刺激,使机体产生抑制结核菌的免疫力,产生这种免疫力包括多种细胞免疫系统,但主要是结核特异的分泌IFN-γ及IL-10的Th1型CD4和CD8细胞系统。虽然这种免疫力限制了结核菌在体内的复制和播散,但也导致了机体的免疫病理损害。结核病的临床表现和自然转归在很大程度上取决于Th1型细胞的保护性免疫与免疫病理损害之间的平衡。CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞,也称CD4+CD25+调节T细胞,是一种具有免疫调节功能(主要是免疫抑制功能)的T淋巴细胞,进入周围组织抑制其他自身免疫细胞,这样使机体保持自身耐受,防止自身免疫性疾病的产生,但这也削弱了机体对感染病原菌的免疫抑制反应。最近的研究结果显示,在人类包括巨细胞病毒、蠕虫、HBV及HIV在内的慢性感染中,CD4+CD25+调节T细胞在免疫抑制中起重要作用。目前人们对决定结核菌感染呈慢性化的因素和结核特异免疫反应被抑制的原因还缺乏清楚的认识,本研究旨在了解CD4+CD25+调节细胞是否在肺结核病的特异免疫中也起调节作用。1材料和方法1.1ppd阳性人群研究对象符合结核菌检查阳性,或病理检查确诊结核,或临床、X线表现及后继的抗痨治疗有效的肺结核患者20例,其中男11例,女9例,平均年龄35.8(18~60)岁。在20例结核病患者中,PPD阳性19例,PPD阴性1例。在治疗前获取外周静脉血25mL作研究样本。排除患乙肝、丙肝、HIV、肿瘤、糖尿病、甲亢、哮喘或自身免疫性疾病的患者,以及使用影响机体免疫功能药物者。正常对照者选择年龄、性别与患者匹配的PPD阳性健康人17例,其中男8例,女9例,平均年龄32.6(24~46)岁。所有研究对象都有幼年时BCG接种史,都自愿参加该实验,并在医院伦理委员会制定的参与该实验知情同意书上签字。1.2抗bmcs血浆用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离抗凝外周血获得外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs),获得的血浆于-70℃贮存,用于检测INF-γ及IL-10。用CD4阴性选择磁珠从PBMCs分离获得CD4+细胞,剩余细胞为CD4-细胞;再用CD25阳性选择磁珠分离CD4+细胞获得CD4+CD25+细胞,剩余为CD4+CD25-细胞。获得的CD4-细胞和CD4+CD25-细胞作为去调节T细胞的PBMCs贮存备用。磁珠分离按试剂盒(MiltenyiBiotech公司)说明书操作。1.3荧光抗体染色对上述分离的各种细胞用FITC-anti-CD4,PE-anti-CD8,CY5-anti-CD3(Immunotech公司)3种荧光抗体染色30min后(使用FIFC-鼠IgG1、PE-鼠IgG1、CY5-鼠IgG作同型对照),再用CY5-anti-CD4(Immunotech公司)、FITC-anti-CD25、PE-anti-FoxP3(Ebioscience公司)染色(操作按说明书进行)(用同型相应抗体作对照)。1%多聚甲醛固定细胞后,用流式细胞仪检测。1.4细胞增殖指数检测取患者及正常人的新鲜分离的PBMCs或去调节T细胞的PBMCs(本实验使用CD4-细胞)2×104放于200μL的96孔板(含10%胎牛血清的1640培养基)中,同时再加入10mg/L的BCG或ESAT-6,各3份。培养72h后,吸出100μL上清液作IFN-γ和IL-10检测;重新加入3H-TdR(5μci/mL)(中国上海原子核研究所)继续培养18h,以细胞收集仪收集细胞,测定cpm值。细胞增殖结果用增殖指数(stimulationindex,SI)表达。BCG(中国成都生物制品研究所)或ESAT-6(中国成都生物制品研究所)的增殖指数分别用含有BCG或ESTA-6的3个孔的平均cpm值与无BCG或ESAT-6的3个孔平均cpm值的比值表示。1.5细胞调感作用从患者外周血PBMCs中分离CD4+CD25+细胞和CD4+CD25-细胞,取CD4+CD25-细胞(2×104/孔)加入96孔细胞培养板中作为效应细胞,在有或没有等量的CD4+CD25+细胞条件下培养时,再加入或不加入10mg/LBCG,各3份。再加入1×105经过丝裂霉素(Sigma公司)处理的PBMCs培养5d,取上清液测定INF-γ和IL-10。1.6ifn和il-10的检测用ELISA试剂盒(R&D公司)按说明检测IFN-γ及IL-10。1.7统计分析采用SPSS13.0软件进行统计学处理。实验数据以均数±标准差(x—±s)(x—±s)表示,使用方差分析及t检验判断差异的显著性。2结果2.1+调节t细胞数肺结核患者(PTB)外周血中CD4+CD25+调节T细胞数占CD4+细胞总数的比例(3.24%±1.96%)显著高于健康正常人群(1.37%±0.51%)(P<0.01)。2.2增殖能力比较肺结核患者外周血PBMCs对BCG抗原刺激后的增殖能力比对照人群明显增强(P<0.01);患者PBMCs对ESAT-6刺激的增殖能力比对照人群也明显增强(P<0.01)(图1)。2.3n-的能力比对照人群明显结核患者外周血PBMCs对BCG抗原刺激产生IFN-γ的能力比对照人群明显增强(P<0.05);患者PBMCs对ESAT-6抗原刺激产生IFN-γ的能力比对照人群也明显增强(P<0.05)(图2)。2.4il-10在pbmcs细胞上的表达肺结核患者外周血CD4-细胞对BCG刺激产生IFN-γ的能力比其PBMCs细胞明显增强(P<0.05),产生IL-10的能力也显著增强(P<0.05);但正常人群外周血CD4-细胞对BCG刺激产生IFN-γ及IL-10的能力无明显改变(表1)。2.5cd4+cd25-细胞培养cd4+cd5从肺结核患者外周血PBMCs中分离的CD4+CD25-细胞对BCG刺激产生IFN-γ的能力比CD4+CD25-细胞加CD4+CD25+细胞共同培养时明显增强(P<0.05),CD4+CD25-细胞对ESAT-6刺激产生IFN-γ的能力也比CD4+CD25-细胞加CD4+CD25+细胞共同培养时增强(P<0.05)(图3A);CD4+CD25-细胞对BCG及ESAT-6刺激产生IL-10的能力也均比CD4+CD25-细胞加CD4+CD25+细胞共同培养时显著增强(P<0.05)(图3B)。3免疫反应的免疫作用本实验发现肺结核患者外周血中CD4+CD25+FoxP3+细胞数占CD4+细胞总数的比例明显高于正常人,与以前的研究一致,说明结核菌感染使机体产生更多的CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞;肺结核患者比正常对照人群外周血单个核细胞(PBMCs)对BCG及ESAT-6(早期分泌的抗原靶-6,一种特异的结核菌抗原)抗原刺激后的增殖能力和产生IFN-γ的能力明显增强。以上结果提示,肺结核患者虽然有增多的CD4+CD25+FoxP3+细胞抑制免疫反应,但肺结核患者PBMCs(包含CD4+CD25+FoxP3+细胞在内的外周血中全部单个核细胞)对结核菌刺激的免疫反应比正常人群增强,机体抗结核菌的总体免疫反应比正常人群增强,这限制了结核菌在体内的复制和播散。虽然这一免疫反应不能把结核菌从体内有效消除而导致患结核病,但是可降低结核患病或减轻结核病的症状。为了更进一步认识调节T细胞与结核菌特异细胞免疫的关系,应用免疫增强及抑制实验研究在除去调节T细胞后这种对结核菌特异的细胞免疫力是否增强,以及CD4+CD25+细胞对CD4+CD25-细胞是否有直接抑制作用。本研究显示,从活动肺结核患者外周血单个核细胞中分离的CD4-细胞(即除去CD4+CD25+细胞后剩余的单个核细胞)对BCG刺激产生IFN-γ和IL-10的能力比PBMCs(含有CD4+CD25+细胞)明显增强,但是来自正常人群的外周血CD4-细胞无这一作用,说明在活动肺结核患者抗结核免疫反应增强,但这一增强免疫反应同时被增多的CD4+CD25+细胞抑制,这有利于保持机体抗结核免疫与免疫病理损害之间的平衡;同时发现,从肺结核患者外周血单个核细胞中分离的CD4+CD25+细胞能抑制患者自体CD4+CD25-细胞在BCG刺激下产生IFN-γ和IL-10的能力。上述体外实验发现CD4+CD25+细胞能抑制结核特异细胞免疫,这提示在肺结核患者体内也可能存在CD4+CD25+细胞对结核细胞免疫反应有抑制作用。总