银屑病患者骨髓cd34

银屑病患者骨髓cd34

根据最近的研究，这种疾病主要是由异常的t细胞疾病引起的慢性炎症障碍引起的。与免疫密切相关的慢性炎症。来自银屑病患者皮损或外周血的T细胞可不同程度模拟银屑病的临床及组织学表现,提示T细胞携带有银屑病的主要发病信息。结合国内外研究结果,由于外周血免疫细胞源自骨髓造血细胞,我们推测骨髓可能在银屑病发病中起着重要的作用。为揭示银屑病T细胞免疫活性异常的根源,我们将有家族发病倾向的银屑病患者骨髓CD34+细胞进行分离,在单层胸腺基质细胞支持下,使其在体外定向发育分化为T细胞,并对其活性进行了研究。对象和方法一、病例选择选择有家族发病倾向(先证者一级或二级亲属中至少有一名患者)的寻常性银屑病患者20例,其中男14例,女6例,年龄24~56岁,平均35.3岁,平均发病年龄28.3岁,病程3周至24年,其中进行期8例,静止期12例,所有入选患者均无任何自身免疫及血液系统疾患,取材前4个月内均未使用过任何免疫抑制剂、糖皮质激素等影响免疫及造血系统的药物。在征得患者同意条件下,于髂前或髂后上棘抽取骨髓10mL。对照组22例,为筛选的血液科骨髓像检查正常者,且入选禁用药条件同患者组。本研究内容经太原市中心医院医学伦理委员会批准。二、细胞磁珠分离试剂盒RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)、氢化可的松均为Gibco公司产品,CD34+细胞及CD3+细胞磁珠分离试剂盒及磁珠分离仪为Dynal公司产品,CD34-FITC、CD4-FITC及CD8-PE荧光标记抗体均为BD公司产品,2-脱氧鸟苷购自上海生工生物工程技术服务有限公司,MTT为Sigma公司产品。白介素4(IL-4)、白介素8(IL-8)及干扰素γ(IFN-γ)ELISA试剂盒购自晶美生物工程有限公司。三、方法1.重组细胞的表达密度梯度离心法分离BMMNC,Tris-NH4Cl液裂解红细胞,离心洗涤后,用含10%FBS的RPMI1640培养基调整细胞至1×108/mL。2.培养链霉素培养基将BMMNC以1×108/mL的密度接种于含20%FBS、5×10-7mol/L氢化可的松、青霉素100U/mL及链霉素100μg/mL的RPMI1640培养基,每瓶10mL培养于25mL培养瓶,于33℃,5%C02培养箱内孵育,培养2d后,去除非贴壁细胞,之后每周半量换液1次,待细胞形成混合贴壁细胞层,呈半融合状态时,RPMI1640培养基洗2次,应用RPMI1640培养基无血清培养48h,收集培养液,离心取上清,0.45μm滤膜过滤,-20℃冻存待用。3.分离缓冲液制备非玫瑰花环细胞应用分离缓冲液重悬BMMNC为1×108/mL,将M450CD34磁珠以4×107/mL加于细胞悬液中充分混合,4℃孵育30min,置磁珠分离仪2min,吸取未与磁珠结合的非玫瑰花环细胞,将磁珠玫瑰花环细胞以4×107/100μL重悬于磁分离缓冲液,加等比例DETACHaBEADCD34释放磁珠,室温孵育45min,置磁珠分离仪2min,吸取未吸附细胞,用分离缓冲液以1000r/min洗涤细胞10min,重悬细胞于1mL分离缓冲液中待用。应用FITC标记CD34单抗免疫荧光染色,流式细胞术鉴定CD34+细胞纯度。4.nks液洗去药物制备胸腺单细胞悬液,培养胸腺基质细胞6d后,在培养液中加1.35mmol/L2-脱氧鸟苷(去残余胸腺细胞)培养3d,大量Hank′s液洗去药物。分别将分离的银屑病患者及正常对照骨髓CD34+细胞以1×105/孔的量加入上述胸腺基质细胞培养体系中,换用含10%FBS、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL、IL-25ng/mL、rhIL-350U/mL、rhIL-61000U/mL、L-谷氨酸1mmol/L及20%骨髓基质细胞条件培养液的RPMI1640培养基培养,每周换液2次。5.细胞培养及转染培养4周时收集非贴壁细胞,严格按CD3+细胞磁珠分离试剂盒说明分离CD3+细胞(具体步骤同骨髓CD34+细胞分离),培养于10%FBS、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL、IL-25ng/mL及PHA3μg/mL的RPMI1640培养基进行T细胞扩增。采用CD4-FITC,CD8-PE进行免疫荧光染色,流式细胞仪测定两组骨髓CD34+细胞分化出的CD3+T细胞中CD4+CD8-及CD4-CD8+T细胞水平。6.mtt比色法检测细胞增殖活性调整上述扩增的细胞至1×106/mL,每孔200μL培养于96孔培养板,参照文献方法按104菌数/mL加入链球菌超抗原(SAg)悬液作为SAg刺激组,未加SAg作为自然增殖组,无血清培养48h,收集培养上清至500μL离心管中-20℃冻存,每孔加5mg/mL的MTT溶液20μL、无血清培养基180μL,设空白对照,继续培养4h,应用MTT比色法测定细胞增殖活性指数。7.标准曲线的绘制每份样品均设复孔,按试剂盒说明操作,最后置芬兰Labsystems全自动酶标仪测450nm处的吸光度值,绘制标准曲线,计算出IL-4、IL-8及IFN-γ的含量。结果一、细胞分离的纯度CD34+细胞分离后经流式细胞仪检测,CD34+细胞比例达89%~98%。二、细胞融合型检测细胞的生长过程加入胸腺单细胞悬液时,板底细胞密集分布,培养2d后,轻轻吹打去除非贴壁细胞时,培养孔底散在分布少量贴壁的纤维样细胞,呈梭形或分支状,培养第6天时,细胞显著增多,散在分布于培养孔底,加入骨髓CD34+细胞后,呈圆形细胞与纤维样细胞混合共存状态。随培养时间的延长,胸腺基质细胞及接种到基质细胞上的细胞成倍扩增,到培养第4周时,培养孔中细胞已呈80%融合状态。收获非贴壁细胞,免疫磁珠法分离的CD3+T细胞经扩增后,可收获3倍的扩增T细胞,经流式细胞术分析结果显示,在经骨髓CD34+细胞定向分化并扩增的CD3+T细胞中可检测到CD4+CD8-、CD4-CD8+T细胞、CD4+CD8+细胞及微量的CD4-CD8-细胞,且银屑病患者组与正常人对照组CD4+CD8-及CD4-CD8+T细胞比例差异无统计学意义(表1)。三、两组增殖活性比较对银屑病患者及正常人对照骨髓CD34+细胞定向分化的T细胞增殖活性分析显示,银屑病患者自然增殖组及SAg刺激组增殖活性均显著高于正常人对照组。银屑病患者T细胞自然增殖组培养上清IL-4、IL-8及IFN-γ水平与正常对照无显著差异,而经SAg刺激后,IL-4水平无显著改变,而IL-8及IFN-γ水平却显著高于正常人(表2)。t细胞增殖活性本研究对银屑病患者骨髓CD34+细胞体外定向分化的T细胞活性进行了研究,而骨髓CD34+细胞体外向T细胞定向分化是研究的技术关键。以往认为T细胞的发育成熟有赖于胸腺的三维结构及T细胞前体与胸腺基质细胞间的相互联系,因此,最初体外研究T细胞发育分化采用了胸腺器官培养,这一体系可以支持骨髓造血前体细胞CD34+细胞体外定向分化为成熟T细胞,但是胸腺器官培养要求条件苛刻。国外学者近年研究显示,单层培养胸腺基质细胞也可在体外支持T细胞的发育成熟,从而使得造血细胞体外向T细胞发育培养手段相对简单化。本研究借鉴这一研究方法,在骨髓基质细胞条件培养液及IL-3、IL-6等细胞因子构建的微环境下,在胸腺基质细胞支持下,成功将银屑病患者及正常人CD34+细胞体外定向发育为成熟CD3+T细胞。通过PHA联合IL-2刺激T细胞扩增,使细胞数达扩增前的数倍,T细胞数量满足了研究要求。经流式细胞仪分析,在筛选出的CD3+T细胞中,银屑病患者组及正常人对照组CD34+细胞分化出的CD4、CD8单阳性T细胞比例差异无统计学意义。对T细胞增殖活性及分泌细胞因子特点的分析结果显示,银屑病患者组分化的T细胞自然增殖组较正常人对照有更高的增殖活性,且培养上清中均可检测到IL-4、IL-8及IFN-γ,但两组间差异无统计学意义,表明定向分化的T细胞具有分泌细胞因