化妆品微生物检测培训

化妆品微生物检测培训内容一、化妆品检测微生物种类1.耐热大肠杆菌群是一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.5℃培养24h—48h能发酵乳糖产酸并产气。2.铜绿假单胞菌属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。另外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃±1℃条件下能生长。3.金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。4.霉菌和酵母菌霉菌是真菌的一部分，其特点是菌丝体较发达，无较大的子实体。酵母菌是真菌的一部分，细胞宽度（直径）约2~6μm，长度5~30μm，有的则更长，个体形态有球状、卵圆、椭圆、柱状和香肠状等。二、微生物检测办法1.基本操作规范①无菌操作用于避免微生物进入人体组织或其它无菌范畴的操作技术称为无菌操作。在多个生物实验中，为了避免微生物地生长和繁殖影响实验的进行，也要在无菌的环境下进行。无菌操作原则：1、环境要清洁，进行无菌操作前半小时，须停止清扫地面等工作。避免不必要的人群流动，避免尘埃飞扬。2、在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区。3、执行无菌操作前，先洗手，并将手擦干，注意空气和环境清洁。4、夹取无菌物品，必须使用无菌持物钳。进行无菌操作时，凡未经消毒的手、臂、均不可直接接触无菌物品或超出无菌区取物。5、无菌物品必须保存在无菌包或灭菌容器内，不可暴露在空气中过久。无菌物与非无菌物应分别放置。无菌包一经打开即不能视为绝对无菌，应尽早使用。凡已取出的无菌物品虽未使用也不可再放回无菌容器内。6、无菌包应按消毒日期次序放置在固定的柜橱内，并保持清洁干燥，与非灭菌包分开放置，并经常检查无菌包或容器与否过期，其中用物与否适量。7、酒精棉球罐每七天消毒一次，容器内敷料如干棉球、纱布块等，不可装得过满，以免取用时碰在容器外面被污染。无菌操作规范：1、使用的培养基、培养皿、三角瓶、蓝盖瓶、生理盐水、（刻度）吸管、胶头等都必须通过无菌解决（高压蒸汽灭菌锅、75%酒精解决）。2、样品外包装、一次性针筒外包装等在拆封前都必须用75%酒精棉球擦拭。3、使用超净工作台前必须提前20分钟打开紫外灯灭菌。4、酒精灯火焰5cm范畴内可认为无菌，在打开或塞上三角瓶或试管塞子必须将瓶口和塞子同时在火焰上烧一圈，并在火焰无菌范畴内打开或塞上塞子，接种或取样时也必须在火焰无菌范畴内；接种环、镊子、剪刀等金属器具使用前必须在火焰上灼烧。5、接种完毕后应立刻将平板、三角瓶放入培养箱培养，使用过的器具应立刻清洗、灭菌。②样品供试液的制备（注意无菌操作）洗发水、沐浴液普通为水溶性液体样品，配制供试液时用灭菌吸管吸10mL样品加到90mL灭菌生理盐水（含玻璃珠的三角瓶）中，混匀后，制成1：10（10-1稀释度）检液。③取样、移液（注意无菌操作）取样、移液时必须使用无菌的吸管或一次性灭菌针筒进行操作，每一支吸管或针筒只能吸取同同样品的同一稀释度液体，取样必须精确，进行移液时不能将吸管或针头伸入容器中。④划线接种（注意无菌操作）提前配制对应的培养基，灭菌，倒平板，待凝固后提前放入超净工作台中；选用平整、圆滑的接种环按无菌操作法挑取少量菌种，将沾菌接种环在培养基的边沿划原始线，而后使接种环在指力作用下作轻快的滑移动作，从培养皿的一种边沿滑向另一种边沿，滑动时用力要均匀，切勿将接种环嵌入培养基内。划完后将接种环在酒精灯火燃烧灭菌，放于原处，盖好皿盖，倒置培养皿，划线全部完毕后放入恒温培养箱中进行培养。2.革兰氏染色原理：革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚，通过初染和媒染，结晶紫和碘液形成特殊复合物，留在细胞壁内，酒精无法脱色去除，呈现紫色；革兰氏阴性菌由于其细胞壁较薄，酒精脱色能将结晶紫颜色脱去，通过蕃红（或沙黄）复染，最后呈红色。操作环节：革兰氏染色法普通涉及初染、媒染、脱色、复染等四个环节，具体操作办法是：1）涂片固定。2）草酸铵结晶紫染1分钟（初染）。3）自来水冲洗。4）加碘液覆盖涂面染约1分钟（媒染）。5）水洗，用吸水纸吸去水分。6）用95%酒精清洗，洗去染液（脱色）。7）蕃红（或沙黄）染色液染1分钟后，自来水冲洗（复染）。干燥，镜检。3.镜检将待检标本取样、制片，在显微镜下观察、分析、判断。显微镜操作环节：1）调节适宜亮度。2）将临时装片在载物台上适宜位置固定好。3）低倍物镜对准通光孔，使用粗准焦螺旋将镜筒自上而下的调节，眼睛在侧面观察，避免物镜镜头接触到玻片而损坏镜头和压破玻片。4）通过目镜观察视野的变化，同时调节粗准焦螺旋，使镜筒缓慢上移，直至视野清晰为止。5）如果在视野中没有被观察对象，能够移动装片，原则为欲上反下，欲左反右。6）如果不够清晰，能够用细准焦螺旋进一步调节。7）如果需要在高倍物镜下观察，能够转动转换器调换物镜。如果视野较暗，可通过1的办法调节；如果不够清晰，可通过6的办法调节，但是不能够用4的办法。8）如果需要在油镜下观察，现在高倍镜下找到菌的位置，放下载物台，在装片上滴一滴香柏油，转动接物镜转换盘，使油镜头于镜筒下方，俯身镜旁侧面在肉眼的观察下，转动粗准焦螺旋使油镜头渐渐下降浸入香柏油内，轻轻接触玻片为止，转动细准焦螺旋，使视野物象达成最清晰的程度，观察结束后，转动粗准焦螺旋放下载物台，用沾乙醚的擦镜纸向同一种方向擦拭油镜，将香柏油擦净。4.微生物生化检测1、耐热大肠杆菌群：产酸产气；G-；靛基质实验阳性。2、铜绿假单胞菌：G-，氧化酶实验阳性，绿脓菌素实验阳性为铜绿假单胞菌；液化明胶实验阳性，硝酸盐还原产气实验阳性，42℃生长实验阳性亦为铜绿假单胞菌。3、金黄色葡萄球菌：G+；甘露醇发酵实验阳性；冻干兔血浆实验阳性。4、霉菌和酵母菌（计数）：虎红培养基置28℃±2℃培养5d。三、微生物全检过程1.培养基的配制及灭菌需使用的培养基：卵磷脂吐温80营养琼脂培养基、虎红培养基、双倍乳糖胆盐培养基、伊红美蓝琼脂培养基、SCDLP培养基、十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基、绿脓菌素测定用培养基、明胶培养基、硝酸盐蛋白胨水培养基、普通琼脂斜面培养基、BairdParker培养基、甘露醇发酵培养基、冻干兔血浆培养基等。培养基普通买配制好的成品，按照阐明进行配制。配制完毕后分装入三角瓶、蓝盖瓶、试管或培养皿中，放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件普通为121℃，20min。2.单项检测流程1、细菌总数：吸取1ml供试液（10-1）移入9ml无菌生理盐水中，混匀制成10-2稀释度菌液，再吸取1ml10-2菌液移入9ml无菌生理盐水中，混匀制成10-3稀释度菌液；分别取1ml各稀释度菌液移入培养皿中，每个稀释度各用2个平皿，注入融化并冷至45℃±1℃左右的卵磷脂吐温80营养琼脂培养基，充足摇匀。凝固后，翻转平板，置36℃±1℃培养48h±2h，观察并统计。另取一种不加样品的灭菌空平皿，加入约15mL卵磷脂吐温80营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36℃±1℃培养箱内培养48h±2h，为空白对照。2、耐热大肠杆菌群：取10mL1：10稀释的检液，加到10mL双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基中，置44.5℃±0.5℃培养箱中培养24h，如既不产酸也不产气，继续培养至48h，如仍既不产酸也不产气，则报告为耐热大肠菌群阴性。如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃培养18h—24h。同时取该培养液1—2滴接种到蛋白胨水中，置44.5℃±0.5℃培养24h±2h。经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。耐热大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边沿整洁，表面光滑湿润，常含有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为耐热大肠菌群，应注意挑选。挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5mL，观察靛基质反映。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反映液面呈试剂本色。3、铜绿假单胞菌：增菌培养：取1:10样品稀释液10mL加到90mLSCDLP液体培养基中，置36℃±1℃培养18h—24h。如有铜绿假单胞菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。分离培养：从培养液的薄膜处挑取培养物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置36℃±1℃培养18h—24h。凡铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周边培养基常扩散有水溶性色素。在缺少十六烷三甲基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平板上，置36℃±1℃培养24h±2h，铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边沿不整，菌落周边培养基呈红色，其它菌不生长。染色镜检：挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶实验。氧化酶实验：取一小块干净的白色滤纸片置于灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取铜绿假单胞菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液，在15s—30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶实验阳性；若培养物不变色，为氧化酶实验阴性。绿脓菌素实验：取可疑菌落2个—3个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置36℃±1℃培养24h±2h，加入氯仿3mL—5mL，充足振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL左右，振荡后，静置半晌。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表达被检物中有绿脓菌素存在。硝酸盐还原产气实验：挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在硝酸盐胨水培养基中，置36℃±1℃培养24h±2h，观察成果。凡在硝酸盐胨水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。明胶液化实验：取铜绿假单胞菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置36℃±1℃培养24h±2h，取出放置于4℃±2℃冰箱10min—30min，如仍呈溶解状或表面溶解时即为明胶液化实验阳性；如凝固不溶者为阴性。42℃生长实验：挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，置于42℃±1℃培养箱中，培养24h—48h，铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。5、金黄色葡萄球菌：增菌：取1:10稀释的样品10mL接种到90mLSCDLP液体培养基中，置36℃±1℃培养箱，培养24h±2h。分离：自上述增菌培养液中，取1—2接种环，划线接种在BairdParker平板培养基，如无此培养基也可划线接种到血琼脂平板，置36℃±1℃培养48h。在血琼脂平板上菌落呈金黄色，圆形，不透明，表面光滑，周边有溶血圈。在BairdParker平板培养基上为圆形，光滑，凸起，湿润，颜色呈灰色到黑色，边沿为淡色，周边为一混浊带，在其外层有一透明带。用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度。偶然会碰到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明带。挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上，置36℃±1℃培养24h±2h。染色镜检：挑取分纯菌落，涂片，进行革兰氏染色，镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，排列成葡萄状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为0.5μm—1μm。甘露醇发酵实验：取上述分纯菌落接种到甘露醇发酵培养基中，在培养基液面上加入高度为2mm—3mm的灭菌液体石蜡，置36℃±1℃培养24h±2h，金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸。血浆凝固酶实验：吸取1:4新鲜血浆0.5mL，置于灭菌小试管中，加入待检菌24h±2h肉汤培养物0.5mL。混匀，置36℃±1℃恒温箱或恒温水浴中，每半小时观察一次，6h之内如呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各0.5mL，分别加入无菌1:4血浆0.5mL，混匀，作为对照。6、霉菌和酵母菌：吸取1ml供试液（10-1）移入9ml无菌生理盐水中，混匀制成10-2稀释度菌液，再吸取1ml10-2菌液移入9ml无菌生理盐水中，混匀制成10-3稀释度菌液；分别取1ml各稀释度菌液移入培养皿中，每个稀释度各用2个平皿，注入融化并冷至45℃±1℃左右的虎红培养基，充足摇匀。凝固后，翻转平板，置28℃±2℃培养5d，观察并统计。另取一种不加样品的灭菌空平皿，加入约15mL虎红培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置28℃±2℃培养5d，为空白对照。

3.检测全过程图解1ml1ml9ml灭菌生理盐水 1ml1ml1ml 加入约15ml卵磷混匀、静置、冷却、凝固、倒置 细菌 脂吐温80培养基 36±1℃，48±h 计数总数 10-110-210-3 霉菌 加入约15ml虎红混匀、静置、冷却、凝固、倒置 酵母 培养基 28±2℃，5d 计数 10ml 伊红美蓝玻璃珠 琼脂培养基 36±1℃，18-24h 有菌生长 镜检 耐热 10ml双倍 划线接种10ml亲水 大肠 乳糖胆盐 44.5±0.5℃，48h 结论性样品 培养基 1-2滴 蛋白胨水 44.5±0.5℃，24±2h 加入靛基质0.5ml 判断阴阳性 通过90ml生理盐水10-1稀释度 镜检 液化明胶实验 铜绿假单胞菌十六烷三甲 不通过 10ml 划线接种基溴化铵琼 36±1℃，18-24h氧化酶实验 硝酸盐还原结论 18-24h脂培养基 产气实验 绿脓菌素实验 90mlSCDLP 36±1℃ 42℃生长实验 液体培养基 镜检 24±2hBairdParker 划线接种平板培养基 36±1℃，48h甘露醇发酵实验结论 金黄色葡萄球菌 冻干兔血浆实验四、其它验证1.冻干菌粉传代培养购置回来的冻干粉菌种（0代）加入5ml适合增殖培养的培养基，在适合的温度下复苏（1代），复苏后的菌种（1代）加入100ml培养基（2代