透皮无创血糖监测中几个关键电化学问题的研究

透皮无创血糖监测中几个关键电化学问题的研究

1无创血糖检测技术糖尿病是人类健康中受影响最大的疾病之一。血糖监测是糖尿病的诊断和治疗的必要手段，受到许多医生和患者的关注。相关研究结果表明,频繁的血糖检测利于患者了解自身血糖的变化,便于及时采取适当的措施将血糖水平调控到正常范围,可减少远长期并发症的发生。但无论是传统的静脉血浆葡萄糖测定还是后来兴起的指血血糖检测都存在着有创、有痛、增加感染机会的弊端,降低了患者进行连续血糖监测的积极性。本课题组根据反离子电渗原理开展了无创血糖研究,开发了基于透皮取样技术和锇聚合物修饰的低浓度葡萄糖传感器的无创血糖仪,其原理是给皮肤施加一定强度的微电流,透皮抽取组织液至体外,采用高灵敏度葡萄糖传感器检测其中的微量葡萄糖,然后计算出血糖浓度。由于传感器采用锇聚合物作为电子媒介体具有较高的灵敏度,适于检测透皮获取的低浓度葡萄糖,但同时也存在线性范围窄、高浓度范围内出现非线性的问题。仪表和传感器的外形特点以及长时间监测血糖的特点也使得传感器上的电化学行为具有独特性。本研究对上述问题进行了分析,并给出相应的解决方案。2实验部分2.1实验载体和仪器葡萄糖生物传感器(实验室自制),采用金工作电极、金对电极和Ag|AgCl参比电极三电极体系,在工作电极上固定了葡萄糖氧化酶(GOD)和辣根过氧化酶(HRP),以锇氧化还原聚合物(Redoxpolymer)作为电子媒介体。WX2006-1无创血糖仪(实验室自制),实验对比仪器为MediSenseue4d1安妥血糖仪。D-葡萄糖(分析纯),磷酸盐缓冲液(PBS,0.01mol/L,pH7.4),实验用溶液均用高纯去离子水配制。动物实验对象为新西兰兔。2.2体表面强化活性透皮无创血糖监测的原理是基于反离子电渗原理进行无创取样,基于酶催化生物传感技术进行葡萄糖的电化学检测(图1)。在生理条件下,人体皮下组织液中的葡萄糖分子会感应出正电荷。仪表通过取样电极在皮肤上施加一定的电压,皮下葡萄糖分子会在电场的作用下向阴极移动并渗出皮外,并在凝胶中向传感器的工作电极扩散。组织液里的微量葡萄糖在GOD的催化作用下被氧化,产物之一H2O2在电极表面的聚合物膜里面被HRP和电子媒介体的联合催化作用下最终被电极还原。还原电流的大小与葡萄糖浓度存在比例关系,仪表根据特定算法可以计算出血糖浓度。2.3皮肤无创血糖检测葡萄糖传感器采用三电极系统,通过交联的方法在传感器表面固定薄层凝胶作为样品收集池。传感器的使用方式是贴在皮肤表面,通过插槽或引线的方式与仪表相连,实现连续的无创血糖监测。用仪表驱动传感器对梯度变化的葡萄糖溶液(使用PBS配制)进行检测,考察其对低浓度葡萄糖溶液进行检测的线性范围。将传感器贴在新西兰兔的皮肤上(实验前进行处理,裸露部分腹部皮肤),通过引线与仪表相连接,进行动物活体无创血糖监测。3结果与讨论3.1双个数模型的引入本研究所用的葡萄糖传感器由于采用锇聚合物作为电子媒介体,提高了电子传递效率而具有较高的灵敏度,可以对μmol/L量级的葡萄糖浓度进行检测,适用于透皮取样量比较少的情况,但是在葡萄浓度超过50μmol/L后,传感器对葡萄糖浓度的响应呈现出明显的非线性(见图2)。在仪表系统中,最容易实现、误差最小的校正关系是一次函数或比例函数,其它曲线难于拟合且受偶然误差的影响较大。因此,如果可能应尽量选取线性关系进行校正。在酶反应动力学中,米氏方程是用于表征酶促反应的起始速度v与底物浓度[S]关系的速度的方程,v与[S]呈双倒数线性关系。而作为一个法拉第过程,电化学电流与电极反应速度成正比,因此电化学电流的倒数与底物浓度的倒数也呈线性关系(公式1)。使用双倒数形式将图2中的电化学电流响应与底物(葡萄糖)浓度表示出来,可得到图3所示的校正关系,电流响应倒数与葡萄糖浓度的倒数之间存在良好的线性关系,将此方程固化到仪表中,可以显著拓宽仪表检测的线性范围。实际应用过程中利用双倒数关系作为校正方程,可以将高灵敏度的葡萄糖传感器的线性范围扩展到1mmol/L以上。对于透皮无创血糖监测,使用反离子电渗方法从皮下组织液抽取出的葡萄糖浓度仅有10-5~10-4mol/L,因此线性范围扩展到1mmol/L,足以满足无创血糖检测的需求。3.2电流响应与t-1/2关系本研究中的传感器检测葡萄糖主要使用计时电流法,其理论基础是:对于受扩散控制的电极反应,当电极电位阶跃到产生极限电流的电位时,工作电极上的电流响应与时间的关系满足Cottrell方程。即在t=0时,电极的电势所引起的电流效应衰减遵循t-1/2规律。式中,Co*为溶液本体浓度,A为指示电极面积,F为法拉第常数,Do为扩散系数。将本传感器置于葡萄糖溶液中,传感器的工作电位为-0.1V,使用计时电流法进行检测,传感器的电流响应与时间、本体浓度的关系符合公式(2)。如图4所示,电流响应与t-1/2呈良好的线性关系,说明为传感器施加的工作电位能够产生极限电流,且电极反应受扩散控制。Cottrell方程的意义在于:电流与时间存在一个固定的关系,确定时刻t后,电流响应与本体浓度成正比,根据检测电流即可获得葡萄糖浓度。动物活体无创血糖监测实验发现,电化学电流的响应比传感器在溶液中衰减快(传感器的工作电位仍为-0.1V),如图5所示,而且电流响应得衰减规律不是遵循t-1/2,而是遵循t-1规律。图6是动物实验过程中传感器暂态电流响应与时间平方根的倒数之间的校正关系。图7为动物活体实验中葡萄糖传感器电流响应与时间的倒数之间的校正关系。从半无限条件变为有限空间,相当于溶液中被认为不变的C0*的替换成按时间衰减的CL。因此,电极上的极限电流为无论从理论推导还是从实际的实验结果均可见,在无创血糖监测电极上,极限电流的衰减符合t-1规律,其意义在于葡萄糖浓度与电化学电流之间存在确定关系,固定一个时刻t对电流进行测量,可以真实反映无创取样过程中渗出皮肤的葡萄糖的浓度。在一般的溶液体系中使用电化学生物传感器时,常常把60s值作为传感器的电流响应的表征。基于上面的分析,在贴皮检测条件下由于电流响应衰减更快,这个时刻应该提前一些,比如40s或30s,但必须避开开始时刻的双电层充电效应。实际研究过程中,取40s作为传感器电流响应的关键点,以这个时刻的电流值进行血糖的推算。另一方面,由于传质速度受到介质致密度的影响,因而电极与皮肤之间的接触压力会对电化学检测造成影响,从而不可避免地引入了透皮无创血糖监测中的一个干扰因素——接触压力。这就要采取压力检测的一些措施,对无创血糖换算模型进行修正。3.3ag—电极掩膜在动物实验和临床实验过程中,常常发生取样电极/对电极引线被熔掉的现象,可称之为“电极损耗”,即溅射在电极上面的金层从电极基底上脱落或电极上出现紫红色,金层变薄呈半透明状。引线一旦被熔断,取样电极便不能再实施反离子电渗取样。经过多次实验发现,引线脱落均发生在没有Ag|AgCl保护的地方。可能有两种原因:(1)作为阳极的抽取电极处在氧化气氛中,很容易使电极氧化。在制作电极的过程中,一般在金层下面先溅射一层铬以提高金层的在基底材料上的附着强度,当抽取电极的阳极覆盖Ag|AgCl作为保护层时,优先发生的反应是:尽管Cr相比Ag更容易被氧化,但在铬层埋在金层之下,而Ag直接接触溶液界面,故Ag优先被氧化,起到了保护电极的作用。但在Ag|AgCl未保护之处,若电极直接接触到皮肤表面的电解质,铬层会被逐渐腐蚀掉,长时间如此,金层失去了赖以附着的基础,便从基底上脱落下来。因此需要将取样电极用Ag|AgCl加以保护,而在没有丝印Ag|AgCl处需要使用掩膜覆盖作保护。(2)对电极发生氧化反应也可能导致金层脱落。对于一般的电化学反应,通常只关注指示电极(工作电极)上的反应;但对于电化学监测,由于反应时间长,需要考虑在对电极上发生的副反应。根据电荷守恒原理,在一个电化学反应体系中,如在工作电极上发生的是氧化反应,则对电极上必然会伴随着还原反应的发生,反之亦然(如图9),即电化学反应体系中的半反应总是成对的。在无创血糖检测体系中,葡萄糖传感器采用锇聚合物作为一种高效电子媒介体进行修饰,在工作电极上发生的半反应是还原反应,因而在对电极(同时也是电渗取样电极)上,发生的必然是氧化反应。如果对电极没有修饰Ag|AgCl,这个半反应必然要使一种粒子发生氧化,有时是O2-:其中,式(6)正是很多三电极电化学系统长时间使用后在对电极发生气泡的原因,如果溅射的金层不是特别致密,又缺少Ag|AgCl的保护,Cr将优先于OH-被氧化,从而导致金层从基底上剥离。图10所示为实验室开发的另一种基于三电极电化学体系的葡萄糖传感器(锇聚合物修饰),对电极和Ag|AgCl参比电极分布在工作电极两侧。在较长一段时间的电化学检测(约2h)之后发现,对电极上出现了紫红色的物质,金层变得很薄,呈透明状。根据上面的分析,可以认为紫红色的物质为Cr3+或水合铬离子。改进了掩膜形状,将取样电极/对电极上没有被Ag|AgCl保护且容易与皮肤接触的部分用掩膜覆盖(通常是绝缘胶),问题得以解决。在掩膜改进以后的动物实验和临床实验中基本不再发生取样电极被“熔掉”的现象(图11)。在透皮无创血糖监测技术,引线一旦“熔断”,传感器的三电极体系遭到破坏,所采集的信号就会完全破坏,也就无法获得正确的无创血糖信息。采取改进后的掩膜之后,这种失效基本消除了。掩膜的意义还在于它能够在一定程度上保护凝胶层,减少与皮肤之间的接触错动,提高无创血糖传感的稳定性。3.4静脉血对患者的血清学检测本研究采用自制的无创血糖仪对动物体内的血糖进行监测。监测过程中定期使用有创血糖仪,采兔子耳缘静脉血进行对比。将这种对比绘制在Clarke图中进行评价(图12)。经软件统计,图12共有97个数据点,70.1%的数据临床准确,29.9%的数据临床相对准确。表明无创血糖仪的值均属于临床准确或临床相对准确,能够反映血糖水平的变化。4无创血糖监测数据分析作为一种有广泛应用前景的医学监测技术,透皮无创血糖监测由于其自身特点使得其研究过程中不可避免地存在一些技术难点。本研究依据基本的电化学原理对透皮无创血糖监测研究中出现的关键问题进行分析,并给出了相应的解决方案。提出了有限空间扩散模型、电极掩膜等一些在透皮无创血糖监测研究中出现的新概念,推动了基于电化学检测的透皮无创血糖监测技术的临床应用。实验表明,在无创血糖监测过程中,传感器的电流响应仍然受扩散控制,但Fick第二定律的边界条件发生了变化。如图8所示,在透皮无创血糖监测技术中,电极与皮肤之间仅