木醋杆菌定向培养束状细菌纤维素的研究

木醋杆菌定向培养束状细菌纤维素的研究

细菌纤维是由微生物（主要是细菌）生产的细胞产物。由木醋杆菌生产的细菌纤维素与植物纤维素相比,具有纯度高、结晶度高、聚合度高、吸水性强、抗张强度好、生物适应性强等独特的性质,所以细菌纤维素作为一种新型生物材料受到了科学界的广泛关注。如今细菌纤维素已成功地应用于食品、新型伤口包扎材料、人造皮肤、高强度纸、声学器材、化妆品、膜滤器、具有环保性能的纸杯等领域。细菌纤维素纤维是由一系列平行排列的D-吡喃型葡萄糖单元链通过分子间氢键形成的。细菌纤维素纤维形成过程分为三个步骤:在静态培养条件下时,细菌先从末端复合物合成亚纤维;在细菌细胞表面长轴方向线性排列着一些孔状位点,亚纤维不断地从这些位点排出,进一步联结结晶成微原纤维;微原纤维聚集成束,而后互相交织形成均匀的三维网状结构,呈白色凝胶状,其悬浮在培养液表面向培养基深层生长。本研究将细菌的运动控制在毛细管模板范围内,通过这种方式可以使细菌纤维素沿着与通道平行的方向排出,又可以阻碍其互相交织而形成三维网状结构,从而获得排列连续均匀的由细菌纤维素微原纤维组成的束状细菌纤维素。这种束状细菌纤维素在伤口缝合线、高强度增强纤维等方面有重大的潜在用途。1材料和方法1.1种子分离、制备菌种:木醋杆菌(Acetobacterxylinum),海南大学提供,本研究室分离纯化并保存。种子培养液:蛋白胨0.5%,酵母膏0.5%,蔗糖2.0%,磷酸氢二钠0.27%,用酸调节pH值至5.0,121℃灭菌20min。玻璃点样毛细管:管长100mm,内径300μm,华西医科大学仪器厂。1.2毛细管的处理与培养种子培养液中接入斜面菌种后于30℃恒温静置培养24h,然后将接种后的种子培养液充满灭菌后的毛细管,将毛细管置于底部有少量无菌蒸馏水(保持湿度,使毛细管内培养液不蒸发)的试管内静置培养若干天。将毛细管取出用水冲洗后,浸泡于80℃、0.1mol/LNaOH溶液,保温2h,除去附着在细菌纤维素上的菌体和残留培养基。然后在蒸馏水中浸泡3d,每半天换次蒸馏水。对处理后的样品进行冷冻干燥。1.3发酵参数的测定pH值测定:使用PHS-3C型精密pH计,上海雷磁仪器厂。1.4tm-100,日本h表观结构:数码相机,日本Nikon4500;游标卡尺,成都成量集团公司。SEM分析:TM-1000,日本Hitachi。FT-IR分析:采用Nicolet570型红外吸收光谱仪(美国Nicolet仪器公司),固体KBr压片。2结果与讨论2.1培养时间对束状细菌纤维素发酵的影响本研究考察了不同时间对束状细菌纤维素生长的影响。图1为束状细菌纤维素长度与培养时间的关系图。从图中可以看出,随着培养时间的延长,束状细菌纤维素的长度增加。但是10d后,即使时间再延长,束状细菌纤维素长度增加不明显,而且会影响其定向生长,产生交联,甚至会开始有少许的降解。因此,定向生长束状细菌纤维素的最佳时间是10d。2.2产品外观分析图2为培养10d后的样品经处理之后冷冻干燥的外观图。图中毛细管内的样品呈乳白色,长度大约0.62mm。2.3细菌纤维素束的扫描电镜图3为未用毛细管做模板生长的细菌纤维素扫描电镜图。从图3可以看到,细菌纤维素具有三维网状结构,它是由大量的细小纤维组成,但这些纤维缺乏取向性,呈无定向分布。图4为以毛细管为模板定向生长的样品扫描电镜图。从图4a可以看出,以毛细管为模板生长的样品是由细菌纤维素微原纤维定向排列而成的纤维素束。这些微原纤维沿着毛细管内壁方向定向生长,排列成纤维束。图4b是细菌纤维素束末端的扫描电镜图。从图中可以看出,随着木醋杆菌的分裂,长出的细菌纤维素纤维是分叉的,但由于毛细管模板的约束作用,分裂后的多个木醋杆菌沿着直线方向运动,最终分泌的微原纤维是朝着一个方向生长而形成微原纤维定向排列的束状细菌纤维素(如图4a)。因此,从上述分析可以判断,以毛细管为模板可以定向生长束状细菌纤维素。2.4结构式有机化合物片段的结构表征为了获得本研究的样品的结构信息,采用KBr压片法对其进行红外光谱分析,结果如图5所示。从图中可以得到,在3409cm-1处有较强的吸收峰,反映了羟基的伸缩振动频率;2902cm-1处为不对称伸缩(νasCH2)或环氧环的C—H伸缩振动频率及分子内氢键;1430cm-1处为亚甲基的变形振动频率;1369cm-1为C—H键的弯曲振动峰。在1057cm-1处的吸收峰,是由C—O键的伸缩振动引起的,是纤维素的特征峰。在900cm-1处的吸收峰是糖苷键的特征峰。由以上分析可推知红外图谱上可能出现的有机化合物基团有:—OH、—CH、—CH2、C—O,这些基团与纤维素分子结构式中所包含的有机化合物基团基本吻合。因此验证了本研究制备的样品确是细菌纤维素纤维。2.5毛细管通道对木醋杆菌生长的控制细菌纤维素是一种由Acetobacterxylinum细菌分泌在体外的多糖。细菌纤维素的亚纤维结晶成长成微原纤维,进一步形成微纤丝束。由于羟基的存在,大量的氢键将纤维素链纠缠在一起使其具有高结晶度、低溶解性和较差的体内降解性,从而形成均匀的三维网状结构。本研究将木醋杆菌限制在毛细管空间中,如图6所示,在毛细管中的气液界面,木醋杆菌沿着毛细管通道做直线移动,纤维素微原纤维的分泌方向和外延沉积方向由通道的方向来控制。因此,沉积在通道中的纤维不再是那种在正常状态下自我聚集而形成的三维网状结构,而是沿着一个方向生长的微原纤维,形成束状的细菌纤维素。即使在培养过程中木醋杆菌会分裂以及接种时细菌的数量不只一个,但是由于毛细管的作用,木醋杆菌在直线方向运动,最终分泌的微原纤维是朝着一个方向生长而形成微原纤维定向排列的束状细菌纤维素。3细菌纤维素的结构本研究以毛细管为模板成功获得了定向生长的束状细菌纤维素,并获得定向生长束状细菌纤维素的最佳时间为10d。从SEM、FT-IR分析得知,以毛细管为模板定向生长的束状细菌纤维素改变了细菌纤维素的微