玉米遗传转化体系的研究进展

.页眉.PAGE页脚..玉米遗传转化体系的研究进展摘要：植物遗传转化是指以植物器官、组织、细胞或原生质体作为受体,通过某种技术或途径转入外源基因,获得使外源基因稳定表达的可育植株。玉米作为世界上主要三大粮食作物之一,是现代食品工业、医药工业和化学工业的重要原料,在世界经济乃至人类生存方面占据肴举足轻重的地位，所以它的遗传转化研究一直受到各国科学家的重视，至今对玉米遗传转化的研究已经取得了一些成绩，本文主要针对近年来玉米遗传转化技术所取得的重要进展进行论述。主要包括玉米转化受体系统、转化方法及其优点与存在的问题以及对未来的展望等几方面论述玉米遗传转化的研究进展。关键词：玉米；受体系统；遗传转化方法0前言近年来，随着环境着人口、资源、环境三者之间矛盾的加剧，转基因作物渐渐地进入人们的视野并且显得极为重要。玉米是重要的粮食、饲料，同时还是制药、淀粉、糖浆、油料、酒精工业的主要原料，在我国经济生产中占有非常重要的地位。所以玉米遗传转化的研究备受各国科学家的重视。自1988年Rhodes等首次获得玉米转基因完整植株以来，玉米遗传转化技术得到了较大的发展[1]。不但许多有价值的基因转入玉米，而且转基因方法也出现了多样化，如基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道法等。随着转基因技术的发展与完善，更多的优良外源基因将被用于玉米的遗传改良，并且为阐述单子叶植物基因表达调控机理提供了新方法。1玉米遗传转化受体系统的研究1．1玉米基因转化受体体系应具备的条件是：1高效稳定的再生能力：用于植物基因转化的外植体必须易于再生，有很高的再生频率，并且具有稳定性和重复性。根据贾士荣等报道认为，用于基因转化的受体系统应具有80%-90%以上的再生频率，并且每块外植体上必须再生丛生芽，其芽数量越多越好，这样才有可能获得较高频率转化。2较高的遗传稳定性：植物基因转化是将外源基因导入植物并使之整合、表达和遗传，从而达到修饰原有植物遗传物质、改造不良的园艺性状之目的，这就要求植物受体系统接受外源DNA后应不影响其分裂和分化并能稳定地将外源基因遗传给后代，保持遗传稳定性，尽量减少变异。3具有稳定的外植体来源：因为基因转化的频率很低，需要多次反复试验，所以就需要大量的外植体材料，转化的外植体一般采用无菌实生苗的子叶、胚轴、幼叶等或采用可快速繁殖的材料。4对选择性抗生素敏感：在基因转化中用于筛选转化体的抗生素称为选择性抗生素，其使用就是要求植物受体材料对所选用的抗生素有一定的敏感性，即当添加在选择培养基中的该抗生素达到一定浓度时能够抑制非转化体植物细胞的生长、发育和分化，而转化的植物细胞由于携带该抗生素抗性基因而能正常生长、分裂和分化，最后获得完整的转化植株。5对农杆菌侵染有敏感性但无过敏性反应：目前用作玉米遗传转化的材料多为A188、B73及其衍生系，或者是用其他玉米自交系配制的杂交组合。将外源基因导入这些材料后，尚需经过大量的回交转育工作才能将这些基因转入有育种价值的玉米自交系。如果将有用基因转入优良玉米自交系中，经分子检测证明其整合和表达后，就有可能作为新系直接配制组合，在生产上利用，这将大大加快基因工程改良现有玉米品种的步伐。1998年，周逢勇通过基因枪法将Bt基因转入玉米自交系P9-10并获得表达，从而建立起这个自交系的遗传转化体系[2]。1、2玉米作为遗传试验材料的优点1生长期较短，繁殖速度快.节约时间。

2具有多对容易区分的相对性状。

3一次产生的后代多，产生的籽粒均在果穗上，容易准确统计。1．3玉米遗传转化常用受体1愈伤组织再生系统：外植体经过脱分化培养诱导出愈伤组织，再经过分化培养获得再生植株。2原生厦体再生系统：原生质体作为受体系统可直接进行转化，而且转化率较高，嵌合体少。但是玉米的原生质体分离较困难，培养周期长，再生频率低，所以，目前已很少应用的较少。3种质系统：种质受体指转基因利用的受体是植物自身的生殖系统，如花粉粒、卵细胞。4直接分化再生系统：直接分化指叶片、幼茎等外植体细胞越过脱分化产生愈伤组织而直接分化出不定芽获得再生植株。李学红等用玉米茎尖离体培养直接产生了雌雄花序[3]。2玉米遗传转化的方法通过特定的方式将外源基因导入到受体细胞内，使之发生定向的、永久的变异，这是遗传转化中极其关键的步骤。迄今为止，玉米的遗传转化的方法主要有基因枪法、花粉管通道法、聚乙二醇介导法超声波介导法电激法子房注射法阳离子转化法以及于20世纪90年代出现的农杆菌介导法。2．1基因枪法1987年，Comell大学的Sanford等人发明了火药式基因枪法，利用高速运动的金属离子将非特异的外源基因导入受体内；1989年Klein等首次获得转基因玉米，用基因枪法将GUS和PAT）基因引入玉米悬浮细胞系；1990年，Cordon-Kamm等用基因枪法将GUS和PAT）基因引入玉米悬浮细胞系，并且获得可育的转基因玉米植株[4].Vain等报道用基因枪转化玉米胚性细胞时高渗和脱水处理可以提高转化频率Koziel用基因枪将GrvLA(b)导入了一个优良玉米自交系的幼胚中，转基因植株能高水平表达GrvLA(b)，在温室和大田栽培中表现出很强的抗玉米螟的能力，且在后代中稳定遗传.Dupuis报道了以玉米幼雄穗为受体材料用基因枪轰击法将GUS和花色素苷合成酶基因el或Peru转化给玉米，并在35S启动子驱动下在轰击后24h在幼雄穗中获得瞬时表达；1996年，Caimi用基因枪法将细菌的淀粉液化酶SacB基因转入玉米愈伤组织，获得可育转化植株，且转化基因能在子代中稳定遗传；1999年，李慧芬等用基因枪法成功地将Bt基因转入了玉米优良自交系F28，并研究了选择次数对转化效率的影响[5]。张秀君等构建了两个含高赖氨酸蛋白质基因cDNA的表达载体，用基因枪法将其导入玉米不同杂交组合的胚性愈伤组织，通过潮霉素筛选，经Southern杂交检测得到了转基因植株[6]。2000年，刘大文等将Z·Zm13-Barnase基因转化经高渗处理的Q31×Z3、Z31×Q31玉米胚性愈伤组织，经过6轮的除草剂筛选获得32块抗性愈伤组织，再生得到24个植株；Southemblot分析证明。其中5个植株中整合有Barnse基因[7]。基因枪法是玉米遗传转化的主要方法，基因枪法不受基因型的限制，但是外源基因整合的拷贝数多，且受体组织的类型对基因枪的转化有影响，有潜在分化能力的细胞的转化率高。2．2花粉管通道法花粉管通道法,是在植物整体水平进行目的基因DNA片段的导人，直接获得转化种子，通过后代的筛选获得带有目的基因的片段。1978(年,中国科学家周光宇先生首创并推广了花粉管通道法，他首先应用花粉管通道法在棉花基因转移上取得成功。1996年，杨利国等利用此花粉管通道法将广谱无毒抗病基因PYH157转入玉米自交系。由于玉米的花柱比较长，在外源DNA导入前必须对果穗进行整理，滴入的DNA溶液量一定要充分，一般每穗0．5～1．0mL，滴人的次数也可随时间段的不同分别滴人，每次滴入的量要足，这样可以充分提高转化效率和试验的准确性。在授粉后18—26h的不同时间段来进行导人，导入时间以早晨4分钟左右为最好[8]。花粉管通道法的优点在于：可向玉米导入目的基因，也可转移含目的基因性状的供体总DNA。这对于目前玉米大多数农艺性状基因还没有完全分离出来的现状具有重要的现实意义。且简便易学。2．3聚乙二醇法1993年，Golovkin等用PEG法将H89的原生质体分别与含有CaMV35S启动子和鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)突变基因(氨甲喋呤抗性)的质粒pMP和pDMP共培养，其中pDMP的re&fir基因插入了玉米Dsl转座子，用氨甲喋呤筛选得到抗性愈伤组织，在不含激素的培养基上再生出植株。Omimlleh等用PEG法将外源基因导人到由HE89的悬浮细胞系分离得到的原生质体，建立了植株再生的转化体系。PEG法转化效牢较高，但必须以裸露的原生质体为受体，而且还受到基因型的限制。2．4超声波法1997年，张宏等首次用超声波法将Bt基因转入玉米，并获得了可育的转基因植株及其后代。超声波法能获得较高的转化效率，但操作繁琐，而且载体DNA在超声波处理过程中容易断裂。1997年，张宏等首次用超声波法将Bt基因转入玉米，并获得了可育的转基因植株及其后代。2．5电激法利用高压电脉冲作用，在原生质膜上“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进对外源基因的提取。柯遐义等利用自制的脉冲式放电电激仪，以具有再生能力的玉米幼胚作受体，成功地将外源基因导人玉米的幼胚细胞并获得转基因植株[6]。Fromm等(1985)用电激法将pat基因导人了玉米原生质体，得到了该基因稳定表达的愈伤组织。随着玉米原生质体再生技术的研究取得进展，1988年，Rhodes等用电激法转化玉米原生质体，首次获得了完整的转基因植株。电激法还可以对幼胚、愈伤组织和胚性悬浮细胞系进行遗传转化。电激法操作简单，不受宿主限制，在玉米遗传转化技术研究的初期得到了较为广泛的应用，但是它的转化效率较低，而且对有壁细胞或组织的转化效果较差。2．6子房注射法子房注射法是指利用显微注射仪或微注射针把外源DNA溶液注入子房中，靠子房产生的压力及卵细胞的吸收使外源DNA进入受精的卵细胞中。1993年，丁群星等在国内外首次报道了使用子房注射法转化玉米,用微玻针将Bt毒蛋白基因导入玉米自交系籽粒，最后获得一株转基因玉米[9]。虽然这些方法不需要建立再生体系．而且可绕过原生质体或组织培养的过程，能直接得到种子,但转化频率过低。2001年，沈世华等利用离体子房注射法转化普通玉米获得成功，比非离体转化效率有所提高[10]。该方法转化率不高,影响转化效率和结实率的原因是子房经注射受害较深而导致败育。应改进注射技术和注射工具，尽量减轻对子房的伤害，提高注射的准确度，并且DNA和注射工具均不能带菌。虽然该方法有缺点，但是仍然具有优势，经过进一步的研究探索，它将成为玉米基因转化的一个重要方法。2．7阳离子转化法阳离子转化法是一种带正电荷的脂质体作载体携带外源基因，与带负电荷的细胞膜融合，把外源基因导入受体细胞。该方法以原生质体为受体材料。有许多研究表明，外源基因被导入原生质体在细胞中能瞬时表达，并且在其再生愈伤组织中稳定整合和表达，但是由此获得的转基因可育植株却很少。玉米原生质体再生植株强烈地依赖于基因型，仅有少数几例对生产价值不大的品系如A188等能再生植株，无法应用于许多栽培品系或品种，因此此转化方法受到很大限制。2．8农杆菌介导法农杆菌介导法是利用根癌农杆菌所含Ti质粒将外源DNA序列转入植物受体细胞。1999年，黄璐等报道了用根癌农杆菌介导的方法转化玉米栽培品种，获得转化植株,并对转化的愈伤组织中沉默的外源基因的甲基化现象进行了分析[11]。2001年，张荣等用含超双元载体和普通双元载体的农杆菌转化玉米幼胚，产生抗性愈伤率分别为29%和22%。2002年，张艳贞等用农杆菌介导法将BT杀虫基因导入优良玉米自交系，以丹340、4112为材料，用带有质粒PGBIL04的根癌农杆菌LBA4404转化幼胚及其初始愈伤组织，获得再生植株，经PCR检测证明目的基因已经整合到再生植株的基因组中[12]。虽然农杆菌作为一种天然的植物基因转化系统，具有转化的外源DNA结构完整、转化机理清楚、整合位点较稳定、拷贝数低、整合后的外源基因结构变异较小等优点，但是农杆菌介导玉米转化中的主要问题是大多数玉米育种骨干自交系转化频率低。农杆菌介导转化玉米是一个复杂过程，受农杆菌、玉米受体及培养环境等多方面各种相互作用因素的影响，所以该方法还有待于进一步的完善。3小结在数十年内，玉米遗传转化有了突破性的进展，玉米的转基因受体材料越来越广泛，转化方法也日趋完善。如今，利用基因枪转化技术获得的抗虫、抗除草剂的转基因玉米已应用于商品化生产，基因枪法不受基因型的限制，但是外源基因整合的拷贝数多，且受体组织的类型对基因枪的转化有影响，有潜在分化能力的细胞的转化率高，而且价格昂贵；PEG法转化效率高，但必须以裸露的原生质体为受体，而玉米原生质体的游离比较困难，同时还受到基因型的限制：电激法操作简单，不受宿主限制，但是转化效率较低；子房注射法的转化率不高，但是仍然具有优势，值得深入研究；阳离子转化法获得可育的转基因植株少，因此，该法受到限制：农杆菌介导法可转移相对较大的DNA片段，获得较多的单拷贝转基因植株．转化效率高，但对有壁细胞或组织的转化效果较差，而且。单子叶植物不能作农杆菌的受体。总而言之，每种方法都不是无懈可击的，都存在缺点，都需要加以完善，必要时，可以尝试将多种方法综合到一起使用，以达到取长不淡的目的。4展望在未来的研究工作中，要加强对各种技术措施的完善，建立完善的各特定基因型的遗传转化技术体系，降低了工作量和难度等。我认为，从目前的形势看，农杆菌介导法已成为玉米也遗传转化的一种主流方式，所以在完善其他方法的同时，可以着重于对农杆菌介导法的研究，克服各种限制因素、降低成本、提高效率，建立完善的遗传转化体系，提高玉米的遗传转化效率和稳定性，从而获得更大的效益参考文献：[1]RhodesCA，PierceDA，MettlesU，etalGeneticallytransformedmaizeplantsfromprotoplastsScirnce，1988，240:204-217［2］周逢勇,王国英,郭三堆,等.玉米自交系P9-10遗传转化体系的建立［J］.科学通报,1998,43（23）:25117-2521［3］李学红,张举仁.玉米茎尖离体培养直接产生雌旌花亭的研究[J].中国科学,1999,29(2)：186—193[4]Cordon-KammWJ,SpencerTM,Mangano