免疫溶血法检测单个补体成分的活性

第十九章

补体检测及应用1整理课件

第一节概述一、补体成分的含量与理化特性二、补体的活化途径

第二节补体总活性测定

第三节单个补体成分的测定一、免疫溶血法二、免疫化学法2整理课件

第四节补体结合试验一、试验原理二、试验方法三、方法评价

第五节补体受体的测定第六节补体测定的应用

思考题小结3整理课件第一节概述补体：具酶样活性、不耐热的糖蛋白其存在与抗原性异物的刺激无关在正常人血清中含量相对稳定某些疾病时，含量及其活性可发生改变4整理课件分类一、补体成分的含量与理化特性根据补体系统的生物学功能，可将其分为：补体固有成分、补体调节蛋白、补体受体(complementreceptor,CR)三大局部。5整理课件补体理化性质由肝细胞、巨噬细胞以及肠粘膜上皮细胞等多种细胞产生均为多糖蛋白，大多数电泳迁移率属α、γ球蛋白含量约占血清球蛋白总量的10%，其中C3含量最高、D因子含量最低固有成份间的分子量差异较大，其中C1q最大、D因子最小。对热不稳定，56°C、30min即被灭活，0～10°C条件下活性只能保持3～4d。多种理化因素如射线、机械振荡、酒精、胆汁和某些添加剂等均可破坏补体6整理课件补体成分分子量电泳区带血清含量参考值（μg/ml）补体成分分子量电泳区带血清含量参考值（μg/ml）C1q390γ270C979α240C1r95β35B95β210~240C1s85α35D25α2C2117β120~30P220γ225C3190β11300C1INH150α180C4180β2430~600C4bp1100250C5190β275I因子93β50C6128β260H因子159β400~480C7120β255S因子88α500C8163γ12007整理课件经典途径二、补体的活化途径8整理课件9整理课件经典激活途径替代激活途径MBL途径激活物质抗原抗体复合物肽聚糖、酵母多糖、脂多糖MBL相关的丝氨酸蛋白酶起始分子C1qC3C2、C4参与补体成分C1、C4、C2、C3、C5-C9C3、C5-C9、B因子、D因子C2-C9、MASP所需离子Ca2+、Mg2+Mg2+Ca2+C3转化酶C4b2bC3bBbC4b2bC5转化酶C4b2b3bC3bnBbC4b2b3b生物学作用参与特异性免疫的效应阶段,感染后期发挥作用参与非特异性免疫的效应阶段,感染早期发挥作用参与非特异性免疫的效应阶段,感染早期发挥作用三种途径比较10整理课件第二节补体总活性测定补体总活性测定方法是以红细胞的溶解为指示，以50%溶血为判断终点，称为CH50补体活化途径不同，应用不同的激活物可活化不同的补体途径基于经典途径的CP-CH50〔临床常规工程〕应用于C3旁路检测的AP-CH50〔尚未列入检验常规〕MBL途径活性测定的可靠方法暂未建立11整理课件〔一〕CH50测定法的原理应用绵羊红细胞〔sheepredbloodcell,SRBC〕和其相应的抗体〔溶血素〕，作为能诱导补体活化经典途径的指示物和激活剂。补体能使溶血素特异性结合的绵羊红细胞溶解，当溶血素和绵羊红细胞浓度恒定时，溶血程度与补体含量和活性相关。将新鲜待检血清作不同稀释后，参加反响体系，测定溶血程度，以50%溶血时的最小血清用量作为判定终点，可测知补体总溶血活性12整理课件溶血程度与补体含量的关系

在适当、稳定的反响系统中，溶血反响与补体的剂量依赖关系呈现“S〞形曲线在轻微溶血和接近完全溶血时，补体量的变化对溶血程度的影响不大，即溶血对补体量的依赖不敏感。但在30％～70%溶血时，补体含量仅出现较小的变动，溶血程度也会发生较大的改变13整理课件〔二〕CH50测定方法1.红细胞浓度的调整绵羊红细胞〔SRBC〕采自绵羊颈静脉，制备脱纤维羊血或用阿氏〔Alsever〕血液保存液制成抗凝血，4℃保存备用。使用前，调制成2%～5%SRBC悬液。为使红细胞浓度标准化，可吸取少量红细胞悬液，参加20～30倍的稀释液，在542nm波长处测定吸光值以调整红细胞浓度。14整理课件2.溶血素滴定溶血素可通过SRBC免疫家兔获得，一般无需纯化试验前需先行加热56℃30min或60℃3min以灭活补体溶血素有商品销售，可按标识效价稀释使用自行制备的溶血素需进行滴定，确定使用浓度，在补体活性测定中，大多使用2个单位。溶血素效价稳定，一般使用3个月后再作重新滴定15整理课件

3.稀释缓冲液

4.50%溶血标准管

5.50%溶血总补体值的计算16整理课件〔三〕方法评价与临床意义方法简便、快速，但敏感性低，补体的活性除与反响体积成反比外，还与反响所用的缓冲液、SRBC的数量以及反响温度有关总补体活性的参考范围为50～100U/mlCH50增高见于：急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等CH50降低见于：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎、急性肾小球肾炎等17整理课件第三节

单个补体成分的测定常作为单个补体成分的检测指标：C3、C4、C1q、B因子和C1酯酶抑制物等测定方法：免疫溶血法〔检测单个补体成分的活性〕免疫化学法〔检测单个补体成分的含量〕自动化免疫散射比浊法18整理课件一、免疫溶血法定义:是根据补体参与抗体介导溶细胞作用的级联效应特征建立的单一补体成分检测法指示系统:以SRBC-抗SRBC为激活物和指示系统参照体系:以人为设计的缺乏某种补体成分的血清为参照结果判度:假设有溶血发生，说明待检标本存在参照血清所缺乏的补体成分，且溶血程度与此补体成分的量呈正比，仍以50％溶血为终点19整理课件参照血清常称之“R〔remove〕〞试剂，即去除某种补体成分之意。已能筛选到的血清有人C2缺乏、豚鼠C4缺乏、小鼠C5缺乏和家兔C6缺乏的血清免疫溶血法常用于C2、C3、C4、C5、C6等补体成分的检测。其中以C3、C4两成分的检测更为常见20整理课件二、免疫化学法免疫化学法分类1.单向免疫扩散

2.火箭免疫电泳

3.透射比浊法

4.散射比浊法前两种方法：手工操作繁琐、耗时长、影响因素多、结果重复性差，已趋于淘汰后两种方法：通过仪器对补体的C3、C4、B因子等单个成分进行自动化测定21整理课件比浊法比浊法原理借助补体的抗原性和与相应抗体反响的前带现象建立的补体单个成分定量检测法。比浊法缺乏必需以过量的某种补体相应抗体为保证自动免疫比浊法反映所测补体成分的绝对量可进行标准化流程管理与质量控制22整理课件第四节

补体结合试验补体结合试验(complementfixationtest，CFT)将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反响系统中抗原或抗体的传统方法。23整理课件一、试验原理作用原理：利用补体的溶细胞作用进行各种物理状态的抗原抗体测定5种成分，3个系统反响系统：抗原〔或抗体〕与待测抗体〔或抗原〕补体系统指示系统：SRBC与相应溶血素。试验时常将其预先结合，成为致敏绵羊红细胞〔sensitizedsheepredbloodcell,SRBCS〕。24整理课件反响分两步进行第一步:反响系统与补体的作用第二步:指示系统利用剩余补体的反响不溶血为补体结合试验阳性，而溶血为试验阴性25整理课件〔一〕.试剂的准备二、补体结合试验方法1.抗原或抗体用于试验的抗原或抗体:

需要纯化纯度愈高，特异性愈强抗原与抗体比例适当:

确定抗原或抗体相应的使用单位采用方阵或棋盘法进行抗原与抗体滴定26整理课件27整理课件血清标本遇有抗补表达象时，可作以下处理：加热灭活时提高12℃－20℃冻融后离心去沉淀以3mmol/L盐酸处理参加少量补体后再行灭活以白陶土处理通入CO2以小白鼠肝粉处理用含10％新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释血清3.待测标本采血并及时别离血清用于检测或－20℃保存备用。试验前，应先将血清56℃加热30min〔或60℃3min〕以灭活补体。28整理课件〔二〕正式试验分类:小量法、微量法，以小量法常用实验过程:稀释和处理后的标本与抗原或抗体、不同含量的补体温育与指示系统共育结果判度:对照管:阴性对照管:溶血阳性对照管:不溶血抗体或抗原对照管:完全溶血待检血清对照管:完全溶血绵羊红细胞对照管:不出现自发性溶血29整理课件补体对照管：受检血清阳性:不溶血阴性:溶血注意:假设上述各对照管不出现预期结果，那么试验结果不可靠，其可能原因应根据出错的对照管进行分析。

2个单位:全溶1个单位:全溶或略带少许红细胞

0.5个单位:不发生溶血30整理课件三、方法评价优点灵敏度高、所测定的抗体水平可达0.05μg/ml，出现交叉反响的机率较小，可检测的抗原或抗体范围广泛，无需特殊设备、结果容易观察、试验条件要求不高现状影响的因素多、各种制剂需要烦琐的稀释和滴定等，现代化、自动化抗原抗体检测方法的不断涌现，补体结合试验逐渐被遗弃补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型，其设计和原理仍对新型免疫方法的建立有着启迪和指导作用31整理课件第五节补体受体的测定补体受体：存在于多种细胞去除免疫复合物、净化机体内环境检测补体受体，有助于判断机体抗感染能力和计数相应的细胞数量32整理课件补体受体目前的补体受体归为以下五类：CR1〔CD35〕CR2〔CD21〕CR3〔CD11b/CD18〕CR4(gp150/95，CD11c/18)C3aR/C5aR33整理课件名称别名CD分类配体细胞分布CR1C3b受体，C4B/C3b受体CD35iC3b、C3b，C4b、iC4b，C3c红细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、树突状细胞、肾小球上皮细胞CR2C3d受体，EB病毒受体CD21iC3b、C3dg、C3d、EB病毒、IFN-αB细胞、树突状细胞CR3iC3b受体、Mac-1抗原CD11b/CD18iC3b、植物凝集素、某些细胞多糖中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞CR4gp150/95CD11C/CD18iC3b、C3d、C3dg中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板C5aR/C3aRCD88C5a/C3a(活化G蛋白)内皮细胞、肥大细胞、吞噬细胞补体受体特性34整理课件第六节补体测定的应用补体相关试验：诊断梅毒螺旋体感染的华氏反响〔已淘汰〕HLA分型的补体依赖性细胞毒试验抗原抗体检测的脂质体免疫试验、免疫粘连血凝试验抗体形成细胞定量检测的溶血空白斑技术免疫复合物测定的胶固素结合试验和C1q结合试验35整理课件应用于补体含量和活性检测的试验

AP-CH50和AP-H50试验:反映总补体活性

溶血试验

免疫化学试验

免疫荧光技术检测补体单个成分及其裂解产物〔C1q、C3SP、C3、C4、B因子等〕和补体受体36整理课件(图)血管神经性水肿补体含量和活性相关的疾病1．免疫相关性疾病：如自身免疫性疾病时，C1、C2、C3、C4和Hf等缺陷；超敏反响时〔III型超敏反响〕，C3a、C5a等过敏毒素的产生。2．与补体有关的遗传性疾病：①C2、C3缺陷导致的严重感染；②与C1抑制物缺陷相关的遗传性血管神经性水肿③SLE患者出现的细胞外表CR1缺陷与C1C去除障碍④涉及I因子、H因子缺陷的肾小球肾炎；⑤DAF缺陷引起的阵发性血红蛋白尿；⑥C1q缺陷表现的严重顽固性皮肤损害，以及C1q、C1r、C4、C2缺陷造成的免疫复合物性血管炎〔包括肾炎〕等。(图)血管神经性水肿37整理课件3．补体含量显著降低的疾病：①消耗增多:免疫复合物形成导致的补体活化和消耗增多.如SLE.②补体的大量丧失:主要见于大面积烧伤、失血及肾脏病患者