比较蛋白质组学及系统研究方法

比较蛋白质组学及系统研究方法1蛋白质的合成受时空等多种因素调控，在不同的组织细胞中蛋白质合成及表达的种类和数量有很大的差异，即使在细胞发育的不同阶段，因不同时期、不同条件，蛋白质组的构成也在不断的变化，是动态的过程第一局部：根本概念2第一局部：根本概念蛋白质组(Proteome)指由一个基因组，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质。比较蛋白质组学：蛋白质组间差异蛋白的研究。3第一局部：根本概念生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离比较蛋白质组学根本技术路线4Introduction蛋白质的提取1蛋白质的分离2蛋白质样品的分析3验证4第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法5Introduction蛋白质的提取1荚膜层细胞粘液层第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态〔包括多数疏水性蛋白〕，且制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰〔如酶性或化学性降解等〕。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。样品的分级处理可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行别离。样品制备对于获得可靠、准确的2D电泳结果至关重要6Introduction第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法增加样品溶解性的手段变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。外表活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种外表活性剂来溶解疏水基团。。复原剂：在变性剂和外表活性剂联用条件下，加用复原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。7第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法—水浴加热处理—TritonX-114相别离法提取膜蛋白—蛋白质沉淀及透析除杂—真空冷冻枯燥硫转运膜蛋白质的有效别离和提取8双向电泳别离膜蛋白第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法9双向电泳具体步骤蛋白预处理〔裂解，水化〕蛋白质上样缓冲液的配制：一定量的蛋白质样品溶解在缓冲液含7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，1%NP-40，2%IPG缓冲液，65mmol/LDTT，0.002%溴酚蓝IPG条重泡涨及上样第一向：IEFIPG条平衡平衡缓冲液Ⅰ(复原)平衡缓冲液Ⅱ(巯烷基化)第二向：SDS胶条染色及脱色凝胶成像及图像分析第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法10凝胶的图像处理分析和差异蛋白质点的挖取及胶内酶切凝胶图像的扫描图像加工斑点检测和定量凝胶配比数据分析数据呈递和解释2-DE数据库的建立差异蛋白质点的挖取胶内酶切ImageMaster2dPlatinum图像分析软件可用于胶的图像分析第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法11Introduction第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法差异蛋白质点的挖取及脱色、胶内酶切元素硫基质中膜蛋白2-DE图谱亚铁基质中膜蛋白2-DE图谱选取差异表达的蛋白质点，经过脱色处理后用胰蛋白酶〔Trypsin〕进行特异性酶切，最后进行质谱分析得到相关肽指纹图谱12目前双向电泳需解决的问题样品的制备及溶解膜蛋白疏水性强初步别离高丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白灵敏度及可重复性第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法13N-端测序：得到的是序列。未知蛋白测序。称为ProteinSequencing。

生物质谱分析：返回的数据是分子量。可以和的蛋白〔数据库〕比对，告诉你是什么蛋白。称为ProteinIdentificationbyMS。比较蛋白质组学主流手段是生物质谱分析，价格廉价，分析速度快。第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法蛋白质样品的分析314第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法15质谱分析原理进样系统1.气体扩散2.直接进样3.色谱离子源1.电子轰击2.化学电离3.场致电离4.激光

质量分析器1.单聚焦2.双聚焦3.飞行时间4.四极杆

检测器MALDI-TOF一级质谱仪，二级质谱，MALDI-TOF-TOF串联质谱仪，LC-MS/MS色谱质谱连用第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法16A.ferrooxidans胞外蛋白质斑点的肽指纹图质谱结果第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法17软件名称MascotSEQUESTX!Tandem软件类型商业软件商业软件免费开源软件数据格式MGF、DTA、PKLRAW、DTADTA、PKL、MGF、mzXML注：在线检索均为免费蛋白质质谱检索常用软件常用的是Mascot第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法18第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法19检索的数据库，可以知道数据库大小匹配的结果大于70分即成功鉴定(可靠性达到显著水平)纵坐标：匹配的蛋白数目阴影线：区分匹配结果可靠与不可靠的分界线横坐标：匹配的蛋白得分小红柱：匹配的结果第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法20第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法21第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法22ProtParam蛋白质序列的物理-化学参数（氨基酸、原子组成，等电点，消光系数等）MultiIdent通过等电点、分子量、氨基酸组成、序列标签、肽指纹数据等识别蛋白AACompSim蛋白质氨基酸组成与数据库进行对比分析AACompIdent通过氨基酸组成识别蛋白质

3DProteinDisplayandSequenceAnalysisforthePC(UIUC)蛋白质三维构象展示第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法23验证41.蛋白质印迹法〔免疫印迹试验〕即WesternBlot▪

试剂准备▪

样品制备▪

含量测定▪

SDS－PAGE电泳▪

转膜▪

免疫反响▪

化学发光▪

凝胶图象分析第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法24未知样品的Ct值，从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法2.荧光实时定量PCR〔Real-timeqPCR〕实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反响中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。RT-PCR结果25第二局部：比较蛋白质组学系统研究方法XANES光谱：对提取蛋白中硫的形态进行分析，