黄体酮对脑梗死大鼠脑组织mmp-9、imp-1表达及血脑屏障通透性的影响

黄体酮对脑梗死大鼠脑组织mmp-9、imp-1表达及血脑屏障通透性的影响

基底金属酶9（matopsis-9，mmp-9）和金属酶组织抑制剂1（tissuebilite-1，tip-1）在脑梗死的病理生理过程中发挥着重要作用。MMP-9在脑水肿的形成过程中具有重要的作用,而TIMP-1则对其具有一定的抑制作用。观察脑梗死后两者表达水平的变化对于评价药物的治疗价值具有重要的意义。近期国外的研究表明,黄体酮对脑损伤具有一定的治疗价值,其可以明显减轻脑组织含水量与促进神经功能的恢复。但是对于黄体酮减轻脑水肿的机制研究甚少。为了解脑梗死后脑组织中MMP-9和TIMP-1表达情况并探讨黄体酮减轻脑水肿的机制,特进行如下研究。1免疫组化染色1.1动物与分组Sprague-Dewley雄性大鼠(郑州大学实验动物中心提供),清洁级,体质量250~300g,共120只。将大鼠随机分成假手术组、模型组、HBC溶剂治疗组和黄体酮治疗组。其中后3组每组设24h、48h、7d3个时间点,每个时间点12只大鼠。1.2动物模型制作及给药方法采用线栓法制备大脑永久性局灶性脑缺血模型。假手术组只分离、暴露血管,不结扎颈总动脉及颈外动脉,不插入尼龙鱼线。选择苏醒后左上肢屈曲、行走时向左侧旋转或左侧肢体瘫痪的大鼠为栓堵成功者进行实验,否则视为栓堵失败,弃之不用。将黄体酮溶于22.5%2-羟丙基-β-环糊精(HBC)黄体酮治疗组于术后腹腔注射黄体酮1次(15mg/kg体质量),以后1次/d;溶剂治疗组给予等体积的环糊精溶液治疗。1.3脑含水量测定每组每个时间点随机选取6只进行脑水含量测定。按麻醉后快速断头取脑,沿桥脑上界水平面切断,称取右半脑组织湿重,110℃恒温烤箱中烘烤48h,称取其干重,计算脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。1.4MMP-9及TIMP-1免疫组织化学检测常规灌注取脑,切取视交叉到小脑前的冠状位切片,经4%多聚甲醛溶液后固定72h,常规脱水石蜡包埋,作2μm厚的切片,HE染色。免疫组化染色采用SP法常规染色。MMP-9及TIMP-1免疫组织化学检测均以细胞质染为棕色为阳性,以PBS代替一抗作阴性对照,用以知阳性切片作阳性对照。每张切片取5个高倍视野,每个高倍视野查100个细胞数,计数其中阳性细胞个数。1.5统计学处理实验数据用均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示。不同组同一时间点数据的比较采用单因素方差分析(LSD法),方差不齐时采用秩和检验。应用SPSSforWindows13.0软件包处理,取α=0.05作为检验水准。2结果2.1各组小鼠脑含水量比较模型组和HBC溶剂治疗组在梗死后不同时间点脑组织含水量与假手术组相比均有增高(P<0.05)。而黄体酮治疗组在各个时间点脑组织含水量则较模型组与HBC溶剂治疗组均明显降低,但仍高于假手术组(P<0.05)。详见表1。2.2综合分析cmp-9免疫组织化学结果假手术组MMP-9的表强度较低;黄体酮治疗组MMP-9的表达强度在各个时间点均低于模型组与溶剂治疗组,且差异有统计学意义,详见表2。2.3稳定性下降4hTIMP-1在假手术组几乎未有表达;而在模型组梗塞后24h达到高峰,48h后开始下降;HBC溶剂治疗组和黄体酮治疗组亦有此规律,但黄体酮治疗组TIMP-1表达均低于HBC溶剂治疗组与模型组,且具有统计学意义,详见表3。3黄体酮的调节作用血脑屏障由毛细血管内皮细胞、基底膜及附着于基底膜外层的星型胶质细胞足突等构成,在维持神经系统内环境的相对稳定方面有着重要的意义。在正常生理情况下血管细胞外基质成分的合成和降解保持着动态平衡,而基质金属蛋白酶(MMPs)与金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)本身的平衡对维持这种平衡起到了重要作用。MMPs/TIMPs的失衡会影响到细胞外基质的合成与降解的平衡。在脑缺血过程中,表达增高的MMP-9通过降解细胞外基质导致脑微血管结构完整性破坏和血脑屏障损坏,造成继发性脑水肿和脑损伤。动物模型研究发现TIMP-1可能产生一种内源性保护作用,且TIMP-1还是MMP-9的特异性抑制剂,因此调节两者在梗死后脑组织中的平衡对维持基底膜细胞外基质正常代谢和血脑屏障完整性方面显得尤重要。黄体酮属于神经甾体激素,是一种新的对中枢神经系统产生广泛影响的神经调质,并且在脑缺血的保护中具有重要作用。本研究通过建立大鼠永久性大脑中动脉阻塞(pMCAO)模型来观察黄体酮对大鼠脑缺血后脑水肿、MMP-9及TIMP-1表达的影响,了解其能否通过调节MMP-9/TIMP-1使其回复正常的平衡状态而起到脑保护剂的作用。结果表明MMP-9在脑缺血24h时表达增加,于48h达到峰值,7d时表达下降,其表达变化与脑水肿程度动态变化发生的时间一致。这也进一步证实了MMP-9与缺血后脑水肿的形成密切相关。研究同时发现应用黄体酮治疗后缺血半暗带内MMP-9表达有明显下降趋势,且脑水含量也较模型组及HBC治疗组明显降低。提示黄体酮可能通过抑制MMP-9的表达来减轻血脑屏障破坏,进而减轻脑组织损伤。实验亦发现TIMP-1在脑梗死后24h达到高峰,48h后下降。应用黄体酮干预后TIMP-1的表达明显降低。这可能与黄体酮通过抑制MMP-9的表达,从而使伴随MMP-9病理性表达升高的TIMP-1也相应减少;也可能黄体酮自身对TIMP-1有一定的抑制作用。综上所述,黄体酮可能通过