黄体酮对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织内水通道蛋白-4的表达及血脑屏障通透性的影响

黄体酮对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织内水通道蛋白-4的表达及血脑屏障通透性的影响

脑损伤（bbb）是脑损伤后血肿破坏的重要病理生理基础。血脑屏障通透性增加形成的血管源性脑水肿是脑缺血再灌注损伤最显著的组织学变化之一。具有神经保护作用的黄体酮(progesterone,PROG)可降低创伤性脑损伤和缺血再灌注后血脑屏障的通透性,减轻脑水肿,但其具体机制尚不清楚。本实验通过建立大鼠大脑中动脉栓塞再灌注模型,观察黄体酮对AQP4表达、血脑屏障的通透性及脑组织含水量的影响,探讨黄体酮减轻脑水肿的可能机制。1材料和方法1.1大鼠分组及分组健康成年雄性SD大鼠96只,体重260～310g,郑州大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为4大组:假手术组(24只)、手术组(24只)、溶剂治疗组(24只)和黄体酮治疗组(24只)。每组设缺血2h再灌注6h、1d、3d、5d4个时间点,每个亚组6只大鼠。1.2颈总动脉的分离采用改良的Longa等线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。大鼠以10%水合氯醛(30mg/100g)腹腔注射麻醉后固定,取颈正中切口,分离并结扎左侧颈总动脉、颈外动脉,在颈总动脉近分叉约5mm处剪一小口,用备好的尼龙线插入颈内动脉,遇轻微阻力止,插入深度为(23±0.5)mm。阻断左侧大脑中动脉血流,造成局灶性脑缺血。术后2h,回拉线栓至颈总动脉,实现再灌注。假手术组不插入尼龙线,余操作同缺血再灌注组。1.3黄体酮应用术后随访结果见表1参照Longa等5分制评分标准:0分:无神经损伤症状;1分:不能完全伸展对侧前肢;2分:爬行时向对侧转圈;3分:行走时身体向对侧倾倒;4分:不能自发行走,意识丧失。1～3分者为实验对象,经解剖发现蛛网膜下腔出血者不计入实验组。将黄体酮溶于2-羟丙基-β-环糊精(HBC),黄体酮治疗组于术后腹腔注射黄体酮一次(8mg/kg),以后每天1次;溶剂治疗组给予等体积的环糊精溶液。1.4测试指标1.4.1小鼠aqp4基因表达的检测取各组大鼠缺血侧半球额顶区皮质100mg,加入组织裂解液,匀浆后离心,取上清液,测定总蛋白含量,并分装放置-20℃保存;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,并将蛋白转至硝酸纤维素膜上;加入兔抗大鼠AQP4多克隆抗体(购于Santacruz公司),4℃孵育过夜;加入辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育2h,ECL光化学法显色,拍片。以β-actin作为内参照,胶片经透射扫描仪扫描后获得图像。利用QuantiScan凝胶图像扫描分析软件测定电泳条带的光密度值,计算AQP4与β-actin光密度的比值。1.4.2线性关系检测BBB的通透性是通过荧光分光光度法测定渗出血管外的伊文蓝(EB)来评价的。各时间点大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉,经股静脉注入2%EB生理盐水溶液(4ml/kg)1h后,开胸通过左心室灌注生理盐水直到右心房流出的液体无色为止,断头取脑,分别取双侧背外侧皮质,样品称重并置于2ml的50%的三氯乙酸中匀浆。匀浆液经离心(10000r/min,20min)后提取上清液。以无水乙醇1∶3稀释上清液后由荧光分光光度计测定其荧光值。校零标准品为50%三氯乙酸按1∶3加入无水乙醇。根据标准曲线求得伊文氏蓝含量(μg/g脑组织)。1.4.3干燥温度的测定在相应时间点,麻醉大鼠后快速断头取脑,取脑组织约120mg,用电子天平称取湿重,然后将标本置于95℃～100℃红外线干燥箱内烘干24～48h至恒重,称取干重。根据下列公式计算脑组织含水量百分比:脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。1.5统计学处理所得结果采用SPSS13.0统计软件进行处理。各项检测结果均以χ¯¯±sχ¯±s记录。采用单因素方差分析(onewayANOVA)进行统计分析,当方差分析有显著性差异时,组间比较行Bonferroni检查,检验水准取α=0.05,当P<0.05时有显著性差异。2结果2.1各组aaqp4表达比较结果显示手术组脑组织AQP4表达在再灌注6h开始增加,1d明显升高,3d达到高峰,5d逐渐降低。手术组AQP4表达明显高于相应时间点的假手术组,差异具有统计学意义(P<0.01);黄体酮组AQP4表达明显低于相应时间点的手术组及溶剂组,差异具有统计学意义(P<0.01)。溶剂组不同时间AQP4表达与相应时间手术组相比差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。2.2eb含量及黄体酮组与手术组eb渗出量的比较表1手术组再灌注6h脑组织EB含量升高,1d～3dEB渗出量达高峰,5dEB渗出减少。手术组EB含量明显高于相应时间点的假手术组,差异具有统计学意义(P<0.01);黄体酮组于各时间点EB渗出量明显低于相应时间点的手术组及溶剂组,差异有统计学意义(P<0.01);溶剂组不同时间EB渗出量与相应时间手术组相比差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。2.3黄体酮和溶剂对小鼠脑含水量的影响手术组脑组织含水量在再灌注6h开始升高,3d达高峰,5d有所下降,手术组脑含水量明显高于相应时间点的假手术组,差异具有统计学意义(P<0.01);黄体酮组各时间点脑组织含水量明显低于相应时间点的手术组及溶剂组,差异具有统计学意义(P<0.01);溶剂组各时间点脑组织含水量与相应时间手术组相比差异无统计学意义(P>0.05)(见表3)。3u3000酸方面血脑屏障破坏与血管源性脑水肿密切相关,是脑缺血再灌注过程中脑损伤加重的主要原因之一。BBB的通透性增加引起大量水溶性物质如电解质进入脑组织,直接引起血管源性脑水肿,导致疾病的病死率明显增加。脑水肿的发生机制尚未完全阐明,可能与细胞能量代谢障碍、脑微循环及血脑屏障障碍、自由基损伤、钙超载、兴奋性氨基酸的毒性作用及水通道蛋白等因素有关。其中,AQP4的作用越来越受到重视。AQP4是中枢神经系统中分布最广泛、含量最高的水通道蛋白,其对维持血脑屏障的完整性及脑内水平衡发挥着至关重要的作用,是哺乳动物在中枢神经系统中的渗透压感受器。AQP4在脑内主要分布于星形胶质细胞、软脑膜、室管膜、脉络丛、下丘脑的视上核和室旁核。其中在与毛细血管内皮细胞接触的终足以及毛细血管内皮上,即BBB的两侧分布最为丰富,因此AQP4在介导水分子透过BBB过程中起重要作用。本实验通过Westernblot法对AQP4的表达进行观察,结果显示脑缺血再灌注后6hAQP4表达开始升高,24h明显升高,3d达到高峰,5d逐渐降低,与既往文献报道一致。实验还表明AQP4表达量与EB的渗出、脑组织含水量变化趋势基本一致,提示AQP4在脑缺血再灌注导致血脑屏障通透性的增加及脑水肿的发生中有重要作用。既然AQP4的高表达与血脑屏障通透性增加及脑水肿的发生密切相关,阻断AQP4的过度表达,抑制或降低其生物活性或许能降低血脑屏障的通透性及脑水肿的程度,从而起到脑保护作用。黄体酮被称为“神经活性甾体”,国内外大量研究表明其在脊髓损伤、脑损伤、癫痫、中风和衰老相关疾病中发挥显著的神经保护和神经再生作用。黄体酮主要通过其保护血脑屏障、抗水肿、抗炎症、抗细胞凋亡、抗氧化应激及改善认知功能而发挥神经保护作用。Guo等在中层额皮质双侧挫伤的雄鼠中发现,黄体酮能显著降低AQP4表达量,减轻脑水肿。在脑缺血再灌注模型中研究黄体酮对AQP4及血管源性脑水肿的作用,国内外均未见报道。本研究应用黄体酮对脑缺血再灌注大鼠进行干预,结果显示:PROG干预组脑组织AQP4表达量明显低于手术组及溶剂组,差异具有统计学意义(P<0.01),且PROG组EB渗出量及脑含水量较手术组及溶剂组明显降低。由此