高原鼠脑组织血管内皮生长因子mrna表达及脑微血管密度的测定

高原鼠脑组织血管内皮生长因子mrna表达及脑微血管密度的测定

血管内皮细胞的生长因子（vgf）也被称为血管透射因子（vpf）或血管松弛素（vacurose）。广泛分布于动物组织中。这是血管内皮细胞的丝状分裂素，是细胞因子的一种。VEGF具有促进内皮细胞增殖、增加血管通透性、诱导血管生成等多种功能。有研究表明,低氧上调VEGF基因的表达,促进毛细血管生长,VEGF基因的表达水平与微血管密度(microvesseldensity,MVD)成正相关。动物组织中MVD增加,不仅能缩短组织中氧气扩散到细胞中的距离,而且也增大了组织与血液进行气体交换的面积,从而提高组织获取氧的效率,增强动物对低氧环境的适应能力。高原鼢鼠(Myospalaxbaileyi)属啮齿目(Rodentia),仓鼠科(Cricetidae),鼢鼠属(Mospalax),是一种世居高海拔地区封闭洞道中的地下鼠,其洞道内含氧量比同地区大气中低20%,而CO2含量平均高于同地区大气中CO2含量7.3~48.6倍。哺乳动物的脑是代谢活动最旺盛的器官,对氧的需求量非常大,仅占哺乳动物体重2%左右的脑组织耗氧量却占全身耗氧量的20%。高原鼢鼠与地面生存的高原鼠兔(Ochotonacurzniae)以及生活在低海拔地区的Sprague-Dawley(SD)大鼠相比,其洞道生境特征不仅是低氧,而且是高CO2浓度。高原鼢鼠脑组织中VEGF基因的表达以及MVD受低氧和高CO2浓度的双重调节,与高原鼠兔和SD大鼠可能存在差异。到目前为止,有关不同低氧生境下哺乳动物物种间脑组织中VEGF基因mRNA的表达和MVD的比较研究尚未见报道。因此,本文通过测定高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠脑组织中VEGF基因mRNA的表达和MVD,并进行比较,以期进一步探讨高原鼢鼠对低氧和高CO2环境的适应机制。1材料和方法1.1实验动物的制备高原鼢鼠捕于青海省湟中地区(海拔约3200m),高原鼠兔捕于海北州门源县(海拔约3200m),SD大鼠购于青海省地方病预防控制所动物中心(海拔约2300m),所有实验动物均于实验室中腹腔注射5%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉,处死动物后取脑和肝组织,置入液氮罐中保存。各组动物样本数为7只。1.2方法1.2.1高原地带大鼠vegf基因克隆1.2.1.总rna的提取用UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)提取高原鼢鼠肝脏组织总RNA,提取的RNA置于1.5mL离心管中-70°C保存。1.2.1.pcr扩增及测序引物设计:在GenBank中下载大鼠(Rattusnorvegicus,NM_031836.2)、小鼠(Musmusculus,NM_001025250.3),地下鼠(Spalaxehrenbergi,AF186236.1)、金仓鼠(Mesocricetusauratus,AF063013.1)和白足鼠(Peromyscusleucopus,DQ358740.1)的VEGFmRNA序列,运用DNA-MAN软件进行同源性比对,用Primer5.0在保守区域设计引物。上游引物:5’-ATGAACTTTCTGCT-STCTTGGRTGC-3’;下游引物:5’-TCACCGCCT-TGGCTTGTCACA-3’,扩增产物片段为645bp左右。目的基因的扩增及回收:提取的RNA用EasyScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix(北京全式金生物技术有限公司)合成第一链cDNA后,用设计的上下游引物进行PCR扩增目的片段,PCR扩增反应条件:94°C5min;94°C30s,60°C30s,72°C1min,38个循环;72°C5min。紫外灯下观察为单一条带。然后按EZ-10spincolumnDNAGelExtractionKit(上海生工生物工程有限公司)试剂盒操作,切胶回收,回收产物置于1.5mL离心管-20°C保存。PCR产物测序:进行TA克隆,在微量离心管中依次加入PCR产物4µL和1µLPEASY-T1CloningVector,轻轻混合,室温(22~37°C)反应5min。反应结束后,将离心管置于冰上。加连接产物于50µLTrans1-T1感受态细胞(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物),轻弹混匀,冰浴20~30min。42°C热激30~45s,立即置于冰上2min。加250µL平衡至室温的液体培养基(LB),200r/min,37°C孵育1h。将LB固体培养基融化,降温至55°C左右后加入氨苄青霉素至终浓度50~100μg/mL,倒板后置于37°C烘箱30min。配制500mmol/LIPTG和40mg/mLX-Gal,按每板8µLIPTG和40µLX-Gal涂板,置于37°C烘箱30min。取200µL菌液铺板,37°C倒置培养过夜(为得到较多克隆,4000r/min离心1min,弃掉部分上清,保留100~150µL,轻弹悬浮菌体,取全部菌液涂板,培养过夜),第二天观察蓝白斑,挑取白斑单克隆于10mL液体培养基中,37°C水浴3~4h后混匀,提取质粒,选择阳性克隆,送北京华大基因有限公司进行序列测定。将获得的序列在GenBank进行Blast比较分析。1.2.2生物信息分析1.2.3免疫组织化学每组动物中随机选取5只做光镜检测。每只动物脑组织纵切和横切的的切片数均不少于5片。取脑组织横切约3mm×10mm×10mm大小,纵切3mm×10mm×10mm大小,4%中性甲醛液固定,室温固定24h。常规脱水、石蜡包埋,LeicaRM2135切片机(德国)行4μm切片。免疫组织化学实验中一抗为CD34兔抗大鼠多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司),1∶40稀释;二抗为PV-6001检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。石蜡切片常规脱蜡至水,微波抗原修复;滴加3%H2O2去离子水室温孵育10min;滴加一抗4°C过夜;滴加山羊抗兔IgG抗体-辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)多聚体,室温孵育20min;DAB显色后苏木精复染中性树胶封片,染色结果在OlympusBX51显微镜(日本)下观察,OlympusDP70图像采集系统(日本)取图。免疫组织化学染色切片按Weidmer等的方法,每张选取热点区拍照8张。采用Image-ProPlus6.0图像分析系统(德国)测量MVD。1.2.4实时荧光定量pcrTRIZOL(Invitrogenlifetechnologies)法提取每组动物中脑组织的总RNA,用NanoDrop®ND-1000测定RNA浓度和纯度,RNA溶液的A260/A280的比值都在1.8到2.1之间。琼脂糖变性电泳检测所提取的RNA的完整性,紫外灯下拍照,28S与18S的条带清晰而明亮,5S条带较浅,说明提取出的RNA较完整。然后使用样品RNA进行cDNA合成,合成的cDNA用于SYBRGreenΙ实时荧光定量。从GenBank中找到相关物种基因的cDNA序列,输入到Primer5.0软件中,通过核酸序列的同源比对找到目的基因的保守区设计引物。GAPDH引物:F:5’-AAGAAGGTGGT-GAAGCAGGC-3’;R:5’-TCCACCACCCTGTTGCT-GTA-3’。VEGF引物:F:5’-CTGGTGGACATCTTC-CAGGAG-3’;R:5’-CTCATCTCTCCTATGTGCTGG-3’。分别将制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板针对每一需要测量的基因和管家基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应,将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为1,分别稀释为1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7这几个梯度浓度的DNA。然后进行Real-timePCR反应,几个梯度稀释的DNA模板以及所有cDNA样品分别配置RealtimePCR反应体系。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线,各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度,即为此样品此基因的校正后的相对含量(实际处理方法:目的基因浓度的对数除以内参浓度的对数)。1.3正态性和方差的同质性检验统计用SPSS(version11.0)统计软件处理,采用Kolmogorov-Simirnov和Levence分别检验数据的正态性和方差的同质性。数据符合正态分布并具有同质性,用One-WayANOVA进行方差分析,采用Duncan’s多重比较,数据表示为mean±SD。2结果2.1高原上的大鼠vegf基因编码区域及其蛋白预测2.1.1高原鼠vegf基因编码区与高原鼠兔、大鼠和小鼠的同源性分析高原鼢鼠VEGF基因的编码区为645bp,通过DNAMAN软件进行序列比对,结果表明,高原鼢鼠VEGF基因编码区与高原鼠兔、大鼠和小鼠的同源性分别为92.1%、93.6%和93.8%。2.1.2vegf-碱基的检测高原鼢鼠VEGF基因编码区编码214个氨基酸,在N端包含一个26个氨基酸的信号肽,成熟的蛋白含188个氨基酸。因此命名高原鼢鼠VEGF的异型体为VEGF188。图2显示其碱基和多肽全长序列、信号肽及功能域位点。预测的功能域位点包括酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(CK-2)、N-糖基化位点(N-glocosylationsite),N-酰基化位点(N-myristoylationsite),蛋白激酶C磷酸化位点(PKC)和cAMP依赖的蛋白磷酸化位点(cAMP)。2.2在高原鼠兔和高原鼠兔之间的生长特性高原鼢鼠大脑组织中VEGF基因mRNA表达水平显著低于SD大鼠(P<0.05),与高原鼠兔没有明显的差异。无论是横切还是纵切,高原鼢鼠脑组织中MVD显著大于高原鼠兔(P<0.05),高原鼠兔显著大于SD大鼠(P<0.05)(表1和图4)。3vegf基因前体mna的基因表达高原鼢鼠和高原鼠兔是生活在青藏高原高海拔地区的两种动物,高原鼢鼠是终生生活在封闭洞道中的地下鼠。因此,两种高原动物都生存在低氧环境中,只是低氧程度不同。有研究显示,高原鼢鼠和高原鼠兔肺扩散容量大、心率低、红细胞数高、红细胞压积低和平均红细胞容积低、血红蛋白氧亲和力高、动脉血与静脉血的氧血红素饱和度差值高,这些生理特征利于提高肺的氧扩散能力,增加血液携氧量,减小血液循环阻力,从而提高血氧利用率,这是两种高原动物长期适应低氧的结果。研究表明,在脑组织中VEGF基因的高表达和MVD的明显增加发生在胚胎发育期和幼鼠期。本文研究结果表明,高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠脑组织中MVD依次减小,且差异显著(P<0.05),与其所处的环境低氧程度的差异表现出一致性,而促进毛细血管增生的VEGF基因在mRNA水平的表达量却呈现相反的趋势。我们认为这与高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠的个体发育阶段有关,本文研究所用的实验动物均为成年动物,高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠胚胎和幼鼠所处环境的低氧程度显然不同,在不同环境低氧条件的诱导下,在个体发育的早期形成了高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠脑组织MVD的显著差异。其次,可能与高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠脑组织中VEGF的亚型组成、不同亚型VEGF的表达水平高低以及不同亚型VEGF对低氧的敏感性不同有关。VEGF基因前体mRNA不同剪接方式形成5种VEGF亚型,所有的亚型都包含1~5外显子,不同亚型中外显子6~8的组合方式不同。5种VEGF亚型根据氨基酸的长短分别命名为VEGF206(包含所有外显子及部分第7个内含子)、VEGF189(包含所8个外显子)、VEGF165(缺少外显子6)、VEGF145(缺少外显子7)及VEGF121(缺少外显子6和7)。由于VEGF进化上有高度的保守性,人与鼠类的差异只有一个氨基酸,所以在鼠中相应为VEGF120、VEGF144、VEGF164、VEGF188和VEGF205。不同的组织含有不同种类、比例的亚型,一般情况下VEGF165为最主要的亚型。目前无论是在正常组织还是病理中,都以VEGF165的表达最高,是其生物学作用的主要形式。体外研究表明,VEGF121和VEGF165能促进培养的牛毛细血管内皮细胞的增殖,而VEGF189和VEGF206不能促进内皮细胞的增殖。研究表明,在高原鼢鼠脑组织中主要有VEGF120、VEGF164和VEGF188,其中以VEGF164和VEGF120为主,在高原鼠兔脑组织中主要有VEGF189和VEGF165,其中以VEGF189为主,在大鼠脑组织中主要有VEGF120、VEGF164、VEGF188和VEGF205,其中以VEGF164和VEGF120为主。随着高原鼠兔生存海拔高度的升高(从3200m到4700m),其脑组织中总VEGFmRNA表达量显著升高,其中VEGF165mRNA表达量没有变化,但VEGF189mRNA表达量显著升高。上述结果提示,高原鼢鼠和大鼠脑组织中VEGF主要亚型组成为VEGF164和VEGF120,高原鼠兔脑组织中VEGF主要亚型组成为VEGF165和VEGF189,并且在高原鼠兔脑组织中VEGF189mRNA表达水平显著高于VEGF165mRNA表达水平,而在高原鼢鼠和大鼠中VEGF164mRNA表达水平显著高于VEGF188mRNA表达水平。但是高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠组织中不同VEGF亚型表达水平、不同VEGF亚型表达对低氧的敏感程度以及不同VEGF亚型对微血管生长的作用强弱,到目前为止尚无系统的比较研究,需进一步探讨。另外,在单纯慢性低氧条件下,大鼠脑组织MVD增加,而在低氧、高CO2浓度条件下,大鼠脑组织MVD减小。因此,高原鼢鼠脑组织表现出较低总VEGFmRNA表达水平,可能与环境高浓度CO2对VEGF基因表达的抑制作用有关。终生生活在地下洞道中的鼹鼠,其组织MVD显著高于平原大鼠。本文研究结果表明,在高原鼢鼠、高原鼠兔和SD大鼠脑组织中,