羟化反应的研究进展

羟化反应的研究进展

这种药物是抗生素的第二次主要药物。它的合成、应用和抗生素被称为20世纪医学工业最受关注的两个成果。主要由植物起源的肥皂组成，并通过化学合成生产皮质产品。近些年来,微生物催化转化在甾体药物合成过程应用的发展迅速,形成了一条生物—化学相耦联的转化新技术。相对化学全合成来说,生物转化有着高效、低成本、低污染等诸多优点。1952年美国普强药厂(Upjohn)的Peterson和Murray首次发现黑根霉(Rhizopunigricans)对甾体具有C11羟化能力,从而使孕酮到皮甾酮的合成缩短为三步,收率达90%,从此解决了可的松等皮质激素类化合物合成的难题,由此开创了微生物转化甾体化合物的先例。1958年黄鸣龙等利用黑根霉将沃氏氧化物引入C11α-羟基,因而开创了从薯蓣皂素通过开环、环氧、羟化、上溴、脱溴、上碘、置换等7步合成可的松的路线。这是我国第一个将微生物用于甾体激素的合成工艺中,使我国可的松的合成跨入了世界先进行列。1关于工程应用微生物羟化、脱氢逐渐成为工业上生产甾体药物的重要手段,其中羟基化反应是甾体药物生物转化类型中最重要的反应。微生物利用酶的作用能在甾体母核的任何位置进行羟基化,而化学方法除了C17容易进行羟基化反应外,在甾体母核其他位置都较难引入羟基。在甾体微生物羟化反应研究中,最为常见的属C11α、C11β、C16α、C9α,因其能产生高级皮质甾类化合物而备受关注,并取得了较大的成果。半个多世纪以来,人们先后在自然界中发现了许多种微生物具有甾体C11的羟化能力,研究较为成熟的有黑根霉(Rhizopusnigricans)、犁头霉(Absidia)、弯孢霉(Curvularia)、小克银汉霉(Cunninghemella)、赭曲霉(Aspergillusochraceus)及绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)等。甾体羟化反应所需的关键酶是一种以游离或膜结合形式广泛存在的细胞色素P450依赖型单加氧酶(mono-oxygenases)。这种酶可以在底物分子中增加一个氧原子,另一个氧原子则用于氧化还原型辅酶Ⅰ(NADH)或还原型辅酶Ⅱ(NADPH),反应如下:根据18O2、DO2及H2O18同位素示踪实验,羟化过程的氧原子不是来自水分子,而是空气中的氧,证实了转化到甾体上的羟基直接取代了甾体碳架上的氢原子,并且取代过程中没有产生立体构象的变化,也不是先通过形成烯的中间体来完成的,这也从理论上说明了工业上用微生物发酵转化甾体时需要提高通气量的原因。微生物C11-羟化反应根据羟化酶可分为C11α和C11β-羟化反应。研究发现,11β-羟基的甾体化合物具有十分重要的药理活性,现有的高级皮质激素药物都具有C11β-羟基。但由于C10位、C13位的甲基容易造成C11β-羟基的立体位阻比C11α-羟基大,并致使C11β-羟基化比C11α-羟基化效率低、副产物多,在一定程度上制约着它的大规模应用。工业上更多的是进行C11α-羟化反应,但因为人体对C11α-羟基甾体不能直接吸收,故需要通过一系列化学反应将羟基构象进行重建,一般方法是先将羟基氧化为羰基再进行还原。2高哌体转化率研究甾体的微生物羟化反应是利用微生物的羟化酶向甾体特定部位引入羟基。一方面由于羟化酶的不稳定性,在提取过程中极易失活;另一方面,甾体化合物的水溶性差(10-6~10-5mol/L),底物的传质成为影响转化反应的关键因素,并且催化反应所需的酶大多为胞内酶,细胞膜通透性也是影响传质的主要障碍。为此,提高底物在转化液中的有效浓度、增加细胞膜的通透性是开发新型转化工艺以提高甾体转化率的关键技术。近5年来,国内外从事甾体C11羟化的研究报道并不多,而国内主要集中于黑根霉、赭曲霉等对16α,17α-环氧黄体酮和坎利酮的C11α羟化以及小克银汉霉和犁头霉对6α,17α-环氧黄体酮和氢化可的松中间体的C11β羟化(表1)。迄今为止,对微生物细胞甾体C11β-羟化酶体系的研究仍较薄弱。虽然C11β-羟化相对困难,投料浓度低,难以实现产业化,但近年来国内也已经出现了一些突破。比如成都生物研究所杨顺楷课题组,利用犁头霉和新月弯孢霉的双霉菌协同转化,在底物投料浓度为0.1%的条件下,转化RSA制备氢化可的松的转化率达到了85%。天津轻工业学院王敏等也有较多的C11β-羟化的报道,在将化合物RS-21醋酸酯转化为氢化可的松的工艺研究中,其β体转化率达75%。还有浙江大学的关怡新课题组利用短刺小克银汉霉C11β羟化转化环氧黄体酮为11β-羟基-16α,17α-环氧黄体酮时,在0.2%的底物投料量下,通过发酵液稀释补料的投料方式,有效地将产物得率从35%提高到43%。2012年,NaghibiF等首次报道了赭曲霉的C11β羟化能力,将皮甾酮(RS)一步转化为氢化可的松。目前,甾体药物的研究主要集中于提高底物溶解性、改善细胞通透性、建立新型转化体系等工艺技术上。2.1对细胞的毒性由于甾体化合物都难溶于水,目前的研究通常先把甾体底物尽可能地溶解于乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙二醇、丙酮等有机溶剂中,然后投入发酵液进行转化。该投料方式往往受到两个因素的限制:一是甾体在溶剂中的溶解度有限,二是有机溶剂对细胞的毒性。徐诗伟等在研究地塞米松中间体的C1,4脱氢和11α羟基化时,采用N,N-二甲基甲酰胺溶解底物后进行投料,使产物转化率提高了约40%,且底物转化完全。万金营等在研究黑根霉催化16α,17α-环氧黄体酮的C11α-羟基化时,底物经吐温-80处理后最终转化率比对照提高了18%。通过添加溶剂提高底物在转化体系中的溶解度是目前甾体微生物转化过程中最为常见和简单的方法,并且在很多的产业化项目上得以应用。笔者曾在上海某公司利用黑根霉、赭曲霉、绿僵菌等对16α,17α-环氧黄体酮进行C11α-羟基化时,通过对添加适当甲醇、乙醇溶剂的方法对工艺进行了改进,使转化率提高约10%。该方法还在节杆菌对地塞米松、倍他米松的1,2位脱氢等工艺上也得到了很好的应用。2.2原生质体的转化多数甾体化合物在水中的溶解度都很低,因此底物在发酵液中的传质是影响转化速率的关键因素。超声波处理、添加表面活性剂、磁场及原生质体处理等都是增强底物溶解性和细胞膜透性的有效手段。阳葵等考察了磁化水处理菌种对羟化16α,17α-环氧黄体酮的效应,结果表明经磁化水处理的绿僵菌对底物11α羟化能力有明显改善。2001年,阳葵等采用单组分分散剂PSE来增加溶液中沃氏氧化物的含量,结果显著加速反应初期的转化,但迅速累积的产物也对中后期的转化产生明显阻遏,其最终转化率约42%。甾体转化过程中,原生质体可以有效解除细胞壁的阻碍作用。1982年,Jawofski等在泼尼松的11β-羟化中利用稀KOH、蜗牛酶、乙二胺四乙酸(EDTA)等处理小克银汉霉孢子,最终羟化产量提高了2~4倍。又如Dtugonski等用溶菌酶处理雅致小克银汉霉(Cunninghamellaelegans)细胞,获得的原生质体转化11-脱氧皮甾醇,5mg底物经4h转化,获得1.1mg11α-羟化产物和0.4mg11β-羟化产物。王敏等利用溶壁酶和纤维素酶处理新月弯孢霉(Curvularialunata)、蓝色犁头霉,对化合物RSA进行了11β羟基化转化,发现原生质体转化速度是菌丝体的1.88倍,在底物浓度相等的情况下,转化周期缩短12h。2.3新的转化体系2.3.1离子液氧化对蝌蚪体催化氧化的影响1991年,InoueA等人研究了油酸/水两液相体系中赭曲霉(Aspergillusochraceus)游离细胞对黄体酮C11α羟基化,发现11羟基化活力取决于有机相与水相的组成比例,油酸的比例越高对强化反应越不利。离子液在甾体转化中的应用也是近年来形成的一种新型转化体系,具有高效、无毒、无污染、回收方便和可重复使用等优势。Wu等发现黑根霉在1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[BMIm]PF6离子液-水组成的两相体系中能将底物转化率提高到90%,且连续利用3个批次后,总转化率仍维持87%以上。两相转化体系在C11羟化的生物转化中研究甚少,但在甾体的微生物转化过程中应用已经非常广泛,本课题组在利用植物油/水—双液相体系转化植物甾醇为雄烯二酮、雄二烯二酮,转化率高。该项目也在多个厂家实现了规模化生产,值得借鉴、推广于甾体C11羟基化。2.3.2性固定化介质对哌体传质的影响固定化技术在甾体药物生物催化中应用广泛。对甾体药物固定化细胞转化技术研究的最多和最有成效的是固定化细胞包埋技术。采用疏水性固定化介质将更有利于水不溶性甾体底物与产物的扩散和传质。由于羟化酶稳定性较差,霉菌的菌丝比较脆弱,因此在甾体11α-羟化生物转化的应用中显得相对困难。台湾的Jer-YiingHoung等报道了在海藻酸钠包埋的凝胶颗粒表层外包裹一层聚尿(polyurea),制得的固定化细胞在双液相体系中进行孕酮的11α-羟基化时,其转化速率为未包裹聚尿细胞的6倍。2.3.3微生物的制备生物转化工艺趋向于高浓度底物转化,采用细粉末固体直接投料方式或采用辅助溶料。由于甾体化合物的疏水性,在底物浓度较高时,产物在发酵液中呈结晶析出,属于拟结晶发酵。这种采用微生物菌体细胞的转化通常分两个阶段,第一阶段是菌体的培养,第二阶段是加入甾体。当前,有一种很具吸引力的生物转化技术,即静息细胞法。静息细胞法又称细胞悬浮法或置换培养法,它将微生物的生长培养同生物转化严格地分开进行。该技术在本单位生物法制备丙烯酰胺项目上已经相当成熟,即微生物的菌丝体经过发酵培养后,采用膜过滤或离心的方法收集细胞,并经过洗涤后悬浮在合适的缓冲液介质中进行生物转化。早在1976年,冯汉昌等就报道了将培养的微生物菌体分离,置于蒸馏水中使化合物“S”在固—液相中进行转化,既可简化工艺,又使氧化速度(C11β-羟化速度)提高1~2倍,缩短了发酵周期。王敏等[6在犁头霉对RSA的C11β-羟基化研究中,筛选了数种缓冲体系对静息细胞转化效果的研究,结果表明柠檬酸缓冲系统有利于C11β-羟基化,且洗涤菌丝体或稀释发酵液可以提高羟化酶的专一性,减少异构体的形成。2.3.4烷基可的松hc的制备协同转化法,即采用多种不同的微生物进行连续或混合培养,同时实现甾体化合物的多步反应。1981年,法幼华等利用诺卡氏菌62-1和蓝色犁头霉AS3.65的协同转化作用将5α-娠烷-3β17α-二羟基-20-酮-21-醋酸酯(RSA)一步转化生成了氢化可的松(HC)。它是通过诺卡氏菌脱氢酶进行C4,5位脱氢,再通过蓝色犁头霉进行水解和C11β羟基化,一次投料即可生成氢化可的松。又如范林萍等建立了蓝色犁头霉AS3.65和新月弯孢霉AS3.4381协同多轮转化(RSA)制备氢化可的松新工艺,在甾体底物RSA平均投料质量浓度为1.3g/L和1g/L的条件下,达到了81.6%和85%的转化率。近年来,有不少关于用多菌协同转化制备甾体激素药物的报道,这是一种新兴的生产技术。该技术通过一次生物转化完成了多步反应,可以大大节约成本,减少环境压力。因此,它也是一种绿色、经济的工艺技术,值得开发。3工程研究趋势近年来,由于皂素资源逐渐枯竭,吸引并刺激了大批国内外研究者对甾体生物转化技术和工艺的开发。经过半个多世纪的发展,甾体的微生物羟化虽然在菌种、溶解度提高、新转化工艺等方面取得了一定的成果,但多数仍处于基础研究阶段,实现产业化的工艺并不很多。中国和印度是甾体激素原料药及其制剂的主要生产国,中国的甾体激素原料药年产值近100亿元,其中70%出口,且皮质激素类原料的生产规模已居世界之首。但很多的原料药却只能出口至印度,印度的厂商经过加工、包装后以成倍的价格出口至美国。这就是技术壁垒所带来的巨大代价,利润微薄,而污染却留在了国内。可见提升我国甾体激素药物生产技术迫在眉睫,任重而道远。在甾体药物的开发过程中,不仅可以通过化学合成法实现生产,某些特定的化学反应通过微生物酶的作用同样能够实现。化学法与生物法的联合应用不仅减少了化学全合成所带来的污染,也大大节约了生产成本。C11羟基化作为生物法生产甾体药物的重要方法之一,已受到了人们的重视。尤其是C11β-羟基的甾体化合物具有十分重要的药理活性,现有的高级皮质激素