黄体酮纯度标准物质的研制

黄体酮纯度标准物质的研制

黄体酮，也被称为妊娠酮，是一种重要的激酶素。黄酮期的血清水平是对预测妊娠、异常怀孕和妊娠的有力诊断依据。准确测定血清黄体酮对相关疾病的正确诊断以及治疗具有重要意义。研制带有准确纯度及不确定度水平的黄体酮标准物质,对相关临床检验具有重要意义,也是国家量值溯源能力的重要保证。1实验部分1.1仪器、试药和仪器1100型高效液相色谱仪(配有二极管阵列(DAD)检测器,Agilent公司);LTQ液相色谱-线性离子阱质谱联用仪(Finnigen公司);Spectrum100型傅里叶变换红外光谱仪、Diamond型示差扫描量热(DSC)仪、Pyris1型热重分析(TGA)仪(Perkin-Elmer公司);7500c型电感耦合离子体质谱仪(ICP-MS,Agilent公司);InertsilODS-SP液相色谱柱(250mm×4.6×5μm,日本GLScience公司)。黄体酮标准物质(自制);乙腈(色谱级,德国Merck公司);其他试剂均为分析纯;实验用水为二次去离子水。1.2定性分析采用液相色谱-质谱联用法(流动注射方式进样)和红外光谱法(溴化钾压片法)对黄体酮标准物质主成分进行定性分析。1.3黄体酮甲醇溶液萃取采用高效液相色谱(HPLC)归一化法与差示扫描量热法(DSC)两种不同原理的方法对黄体酮标准物质进行定值分析。以两种方法的平均值定值。高效液相色谱法条件:流动相等度洗脱,V(水)∶V(乙腈)=50∶50(根据文献进行条件优化,使杂质与主成分尽量分离);流速:1mL/min;进样量:1μL;样品为4mg/mL黄体酮甲醇溶液;检测波长:200、236、254、320nm。定值波长236nm。差示扫描量热法参照ASTM标准方法,温度程序:从116℃升温至130℃,升温速率1℃/min。1.4杂质分析1.4.1水测试采用热重分析(TGA)法进行水分的测定。1.4.2黄体酮质谱成分分析基于DZ/T0223-2001“电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分析方法通则”,采用ICP-MS分析测定了黄体酮标准物质的67种元素含量。1.5瓶内均匀性检验根据《一级标准物质技术规范》(JJG1006-1994)的要求对上述标准物质进行了均匀性检验。具体抽样检验方法为:从每种标准物质中随机抽取15个包装,进行瓶间均匀性检验;再任意一瓶取7个子样,进行瓶内均匀性检验。检验方法为定值方法的HPLC法,测量数据进行F检验和t检验。1.6标准物质纯度稳定性测定根据《一级标准物质技术规范》,标准物质稳定性考察按先密后疏的原则,在一定时间间隔内选择定值方法即液相色谱法(HPLC),检测在规定条件下保存的标准物质纯度随时间的变化情况,通常情况下,分别在第1、3、6个月进行稳定性监测。每次取5个包装,每个包装取一个子样,测3次,计算平均值,把5个包装测量结果平均值作为检测结果。结果的变动在定值结果不确定度范围内作为判定标准物质稳定的原则。1.7不确定度分析1.7.1定值结果引入的不确定度1)液相色谱法定值测量重复性引入的不确定度u1(A类不确定度),由测量的相对标准偏差(RSD)计量。2)不同检测波长下各组分响应差异对定值结果引入的不确定度u2:式中Bi为杂质i定值波长下面积百分比;u2-i为杂质i最大响应波长下面积与定值波长下面积的差异。3)仪器检测线性引入的不确定度u3。由于分析过程中均在仪器检测线性范围内进行,故该部分不确定度可忽略不计。合成HPLC检测标准不确定度:1.7.2b类不确定度ub1)差示扫描量热法测定重复性引入的不确定度uA(A类不确定度),由测量的RSD计算。2)由实验测量中各量的变化来计算的B类不确定度uB。DSC测定不确定度:1.7.3引入水和有机元素的不确定根据水分和无机元素测定的结果,对于含量<0.1%者,忽略不计;对于含量≥0.1%者,将其直接加和到最后结果的杂质不确定度中。1.7.4标准物质的定值不确定度如果标准物质在均匀性检验与稳定性考察中,经过检验可证明其不确定度可以忽略不计,则标准物质的定值不确定度由两种定值方法的不确定度及杂质引入不确定度组合而成。1.7.5相对扩展率的不确定2结果与讨论2.1黄体酮定性测定图1为黄体酮的质谱图,可以看出分子离子峰(M+H)+的质荷比m/z为315.4,等于黄体酮相对分子质量(314.46)加上氢原子量(1.0),可以初步对黄体酮定性。红外光谱结果如图2所示,黄体酮纯度标准物质的红外光谱图与黄体酮标准红外光谱图一致,可以确认样品原料为黄体酮。2.2黄体酮标准物质的表征为了避免方法引起的系统误差,以两种方法的平均值作为黄体酮标准物质的纯度值。图3为黄体酮标准物质的高效液相色谱图,图4为差示扫描量热法谱图。表1为黄体酮标准物质的测定结果。2.3无机元素含量对标准物质定值的影响水分测定结果为0.071%,水分在样品中含量很低,在万分位上,对千份位上的纯度定值结果影响极小,故可以忽略不计。使用ICP-MS测定了黄体酮标准物质中Li、Be、B、Na、Mg、Al、K、Ca、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Rb、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Sn、Sb、Te、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Th和U共67种无机元素,含量总和为0.000015%,对标准物质的定值结果影响甚微,故可以忽略。2.4瓶内均匀性检验随机抽取的15个包装进行瓶间均匀性检验的结果,以及任意一瓶取7个子样的瓶内均匀性检验结果如表2所示,通过其中F检验与t检验,证明标准物质瓶内和瓶间样品均匀一致。2.5黄体酮纯度值的不确定度稳定性检测结果表3所示。从表中数据看,在考察时间内,黄体酮纯度值在分析值的不确定度内,波长范围≤0.1%,并且没有显著的逐渐增大或减少的趁势。说明在此期间内稳定。2.6不确定度评估2.6.1检测波长对响应差异引入的不确定度u液相色谱法定值测量重复性引入的不确定度u1由测量的相对标准偏差计算,u1=0.003%。各组分在不同检测波长下响应差异引入的不确定度u2=0.006%。液相色谱分析合作标准不确定度:2.6.2相对标准偏差的计算差示扫描量热法测定重复性引入的不确定度uA,由测量的相对标准偏差计算,即uA=0.04%。由于DSC定值结果为99.04%,因此杂质含量B杂质%=0.96%,故B类不确定度uB:DSC合成测定不确定度:2.6.3不确定度的检验由于在本课题中,水分与无机元素引入的不确定度皆可忽略不计。而且由于黄体酮纯度标准物质在均匀性检验与稳定性考察中,经过检验可证明其不确定度可以忽略不计。因此,黄体酮纯度标准物质的合成不确定度为:2.6.4相对扩展率的不确定2.7确定值结果和不确定值结果本文研制的黄体酮纯度标准物质定值结果为:99.2%,相对扩展不确定度为0.5%。3黄体酮纯度标准物质的测量原理本文使用两种不同方法对黄体酮标准物质进行了定性分析,确保了结果的可靠性。而且,使用两种不同原理的方法对黄体酮标准物质进行定值分析,防止了由单一方法定值测量的系统误差问题,所得结果可作为标准物质的准确含量值。本文还对黄体酮标准物质进行了杂质分析、均匀性检验、稳定性考察、不确定度评定,确保