环氧黄体酮的11羟化工艺研究

环氧黄体酮的11羟化工艺研究

1微生物法上的11-羟基化在牌糖皮质激素类抗炎药物中，11个羟基是药物具有抗炎活性的必要基团。尤其是11基是药物的自然结构，它可以直接被人体吸收，并快速发挥药物的作用。因此，该抗炎药物的11个氨基酸是-k3。工业上引入11β-羟基的方法一般是先通过黑根霉生物转化在11位上引入α-羟基,再结合化学途径将11α-羟基氧化还原后重建得到11β-羟基。该方法存在工艺路线复杂、副反应多和产率低等缺点。因而,在该类药物的合成路线中,11位β-羟基的引入是最困难也是最关键的一步。如果能采用微生物法直接引入11β-羟基,则可使合成路线大大简化。具有11β羟化能力的微生物主要有新月旋孢腔菌(Cochlioboluslunatus)和新月弯孢霉(Curvularialunata)等,投料浓度一般低于0.5guf0d7L-1,β羟化产物得率在40%左右。小克银汉霉属也是一类具有较好羟化能力的菌种,国内外该菌属中微生物主要被用于模拟研究药物在体内的代谢路径,相关报道称该菌株对药物的羟化能力大约在投料0.1guf0d7L-1时转化50%左右。2009年,徐银等将雅致小克银汉霉用于催化羟化环氧黄体酮,该菌种具有11α羟化能力,但与工业应用的黑根霉11α羟化效果尚存一定差距。2007年,Manosroi等利用短刺小克银汉霉菌直接将可的松醋酸酯11β羟化生成氢化可的松醋酸酯,得率可达85.6%,但是投料浓度只有0.15guf0d7L-1。本文将短刺小克银汉霉用于环氧黄体酮的11β羟化过程,对其转化过程进行研究,通过工艺条件优化提高菌株催化能力和底物投料浓度,以获得稳定的11β-羟基化产物。11β-羟基环氧黄体酮是糖皮质激素类抗炎药物如倍他米松、氢化可的松和泼尼松等合成中重要的中间体,在甾体药物生产中具有广阔的应用前景。2实验材料和方法2.1环黄体酮cc短刺小克银汉霉菌CunninghamellablakesleeanaATCC8688a购自美国标准菌种保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)。环氧黄体酮,市售工业品,纯度≥98%;11α-羟基环氧黄体酮标样为浙江仙居药业公司提供;其他生化试剂均为进口或国产分析纯。2.2基本发酵培养基斜面培养基:葡萄糖2%,土豆汁15%~20%,琼脂2%~3%,pH6.5;基本发酵培养基:葡萄糖70guf0d7L-1,酵母膏2guf0d7L-1,蛋白胨1guf0d7L-1,烟酸0.2×10-3guf0d7L-1,核黄素1.13×10-3guf0d7L-1,pH6.0。2.3霉菌催化羟化反应取1mL发酵液,用乙酸乙酯萃取出转化产物与未转化底物。采用高效液相色谱法(HPLC1100,Agilent),ODS.5μm,4.6mm×250mmC18柱,检测波长240nm,流动相为乙腈:水=5:5(V/V)。用面积归一法,由霉菌催化羟化后的11β羟化产物峰面积与所有峰面积的百分比表示产物得率(Yield);全部产物峰面积与所有峰面积之和的百分比表示底物转化率(Conversion)。2.4实验方法2.4.1菌种培养和接种将冷冻保藏的C.blakesleeana菌株经斜面活化两代,培养至菌丝可观察到孢子,此时菌株可供发酵使用。用无菌水将孢子洗下,接种至种子液摇瓶中,培养6~10h;再接种至装有50mL发酵培养基的250mL摇瓶中继续培养24h后,辅以适当分散剂投入底物环氧黄体酮,投料浓度为2guf0d7L-1,转化48h后取样分析。2.4.2产物的分离纯化霉菌催化羟化底物后用乙酸乙酯萃取出转化产物以及未转化的底物,过硅胶柱(流动相乙酸乙酯:环己烷=3:7),除去底物以及大部分副产物,再利用半制备型色谱(岛津高效液相色谱仪,Waters5μm,10mm×250mmC18柱,流动相乙腈:水=5:5,流速2mLuf0d7min-1)分离得到纯度为99%的目标产物组分,经过重结晶后得到纯化产物样品。将此样品分别进行质谱(Esquire-LC/MS,Bruker)、红外(Nexus670,Nicolet)以及核磁共振氢谱(AvanceDMX500,Bruker)表征,利用自动数字旋光仪(AutopolⅣ,Rudolph)测定产物的比旋光度,并与11α-羟基环氧黄体酮标准品进行比较。2.4.3培养基配方优化用单因素法对发酵培养基主要成分葡萄糖、酵母膏和蛋白胨的组成进行优化,确定培养基的适宜pH,考察接种量、投料时间以及摇床转速对转化过程的影响。2.4.4环糊精的投料方式底物直接投料、用有机溶剂作为溶媒投料、与添加β环糊精或十二烷基苯磺酸钠作为辅助分散剂的水溶液投料等四种投料方式进行比较;并考察不同有机溶剂以及溶剂用量对有机溶剂投料过程转化结果的影响。2.4.5稀释补料的投资菌种活化以及种子液培养同2.4.1节。种子液接种至发酵液培养12h后,将发酵液一分为二,同时补加新鲜的发酵液至原体积,再进行投料。3结果与讨论3.1-羟基环氧黄体酮的结构表征在纯化产物的质谱图中,m/z为367.3和345.4处各有一个较大峰,分别是样品分子与钠离子和氢离子结合后形成的,可知样品相对分子质量为344.4,与11β-羟基环氧黄体酮的相对分子质量344.453相符。纯化产物与11α-羟基环氧黄体酮标准品的红外吸收谱图及氢谱比较见表1,从表中可知该纯化产物确实是环氧黄体酮11羟基取代后的产物,而且与11α-羟基环氧黄体酮在分子结构上存在差异。纯化产物的比旋光度[uf061]D20(28)(10)77.6uf0b0(c(28)1,CHCl3),11α-羟基环氧黄体酮标准品的比旋光度[uf061]D20(28)(10)121.2uf0b0(c(28)1,CHCl3);两者比旋光度不同,说明产物不是11α-羟基环氧黄体酮,而是β构象。经过质谱和红外表征,可以判定转化产物是11-羟基环氧黄体酮,再结合核磁共振氢谱以及比旋光度测定,可以确定C.blakesleeana转化产物是11β-羟基-16α,17α-环氧-孕甾-4-烯-3,20-二酮。3.2干预培养基的组成和工艺条件3.2.1短刺小克银汉霉催化的他因素组成对基本发酵培养基中三种主要成分葡萄糖、蛋白胨和酵母膏进行单因素优化,考察了碳源和氮源浓度对菌株催化能力的影响(其他因素与基本发酵培养基初始组成相同),结果列于表2。据报道,短刺小克银汉霉催化转化所得产物不单一。为使底物能被有效的转化,所以希望在底物转化率高的同时,产物得率也尽可能达到最高。从表2结果,根据得率最高可以得到培养基中三种成分的最佳组成分别为:葡萄糖30guf0d7L-1,蛋白胨2guf0d7L-1,酵母膏4guf0d7L-1。3.2.2ph对羟化底物能力的影响将优化后的培养基配制成一系列pH,考察pH对菌株催化能力的影响,结果见图1。pH在低于5.5或高于7.0后,菌株羟化底物的能力都下降很快;在pH5.5~7.0,羟化能力比较稳定;其中pH为6.0时,转化率可达57%,产物得率为37%,确定培养基最佳pH为6.0。3.2.3摇床转速对转化结果的影响接种量分别为2%、6%、10%、16%、20%,考察了接种量对霉菌转化的影响,结果见图2。可以看出,接种量为10%(V/V)时转化效果最佳。发酵液接种后,分别在培养18、20、22、24、26h后投料,考察了投料时间对转化结果影响,结果见图3。在种子液接种22~24h后投料转化结果比较理想。将摇床转速分别设定为150、200及250ruf0d7min-1,考察其对转化结果的影响(图4)。菌株生物催化环氧黄体酮羟基化过程实际上是菌株内的P450单加氧酶参与的一个需要氧气存在的氧化还原反应。摇床转速对催化反应中氧气的供给有很大的影响,从图4可以看到,当摇床转速为200ruf0d7min-1时,微生物催化效果最好,转化率和产物得率最高;而当摇床转速150ruf0d7min-1时,微生物催化羟化反应所需要的氧气供应不足,造成P450单加氧酶催化羟化能力大幅度下降;当摇床转速为250ruf0d7min-1时,β羟化产物得率也很低,可能是因为转速太高,菌株生长状况受到较大影响,体内代谢发生变化,羟化酶酶活不稳定,使得底物转化没有向β羟化产物方向进行。由此可见,最适转速为200ruf0d7min-1。3.3溶剂用量对分离效果的影响底物在发酵液中溶解度偏低是导致甾体类药物微生物催化效率不高的主要原因。针对这一瓶颈问题,研究了不同投料方式对微生物催化转化结果的影响。首先,考察了四种不同投料方式(添加β环糊精的拟结晶投料、添加十二烷基苯磺酸钠作为分散剂的水溶液悬浮投料、直接粉末投料以及有机溶剂乙醇投料)霉菌催化转化情况,结果见图5(a)。对于本实验的菌株,利用水溶液投料方式,底物转化率确实有较大程度的提高,甚至可以达到90%以上,说明水溶液悬浮投料有利于底物在发酵液中更好地被菌株利用;而用有机溶剂投料时,底物利用率相比降低到60%左右,这是因为有机溶剂虽然可以提高底物的溶解度,但对菌体本身具有毒害作用,会抑制菌体的过度生长,具有调节代谢和改变细胞结构等作用,一般而言在甾体转化中,水溶液投料可以提高菌株利用底物的能力。但是对比不同投料方式时目标羟化产物的得率,发现前三种投料方式中目标羟化产物的得率都很低。究其原因,可能是由于短刺小克银汉霉胞内酶系复杂,对底物催化具有多样性。水溶液投料方式加入的吐温80或十二烷基苯磺酸钠对菌株代谢途径有较大的影响,菌体的11位羟化能力下降,大部分底物被转化为副产物。当用有机溶剂投料时,小分子有机溶剂可以抑制酶蛋白的失活,增强酶的活性,从而提高P450酶羟化能力以及专一性。所以有机溶剂相对其他投料方式,微生物催化转化底物的方向相差很大。鉴于有机溶剂对短刺小克银汉霉菌11β羟化能力有显著影响,分别用发酵液体积1%、2%、3%、4%、5%的水溶性有机溶剂包括乙醇(ethanol)、甲醇(methanol)、N-N二甲基甲酰胺(DMF)、丙二醇(propanediol)作为溶媒溶解底物后投料,四种有机溶剂下最佳转化结果比较见图5(b)。从图5(b)可以看到,用乙醇投料,产物得率是同批次中最高的;用DMF投料,虽然得率没有乙醇高,但是转化产物的纯度比乙醇投料要好;用甲醇或者丙二醇投料,都没有乙醇投料效果好。综上所述,乙醇投料产物得率较佳,选择不同的乙醇用量优化乙醇投料方式,结果见图6。乙醇用量过低时,不利于底物在发酵液中的分散,所以转化率和得率都不高;适当增加乙醇用量时,转化率逐渐下降,产物得率上升;乙醇用量过高时,对转化率和得率都不利;可见适当的乙醇用量可以提高羟化能力以及酶的专一性,实验结果确定最适乙醇用量为发酵液体积的6%。经过培养基组成及工艺条件优化,可以将C.blakesleeana催化环氧黄体酮11β羟化反应在底物转化率稳定在65%左右的情况下,产物得率维持在35%左右。3.4投料方法对转化产物得率的影响有研究报道利用稀释投料,可以使绿僵菌羟化环氧黄体酮的能力提高。为改进菌株后期催化能力,提高在高投料浓度下转化产物的得率,采取稀释补料方法进行投料,结果见图7。从图可以看出,在发酵液培养12h后,利用稀释补料投料,即将发酵液用新鲜培养基稀释一倍,减少了发酵液中的生物量,并补充了羟化反应所需的能量和生长因子,从而将产物得率从35%提高到43%。这一转化结果已将霉菌投料浓度提高10倍以上,而转化率也相对较高。4短刺小克银汉霉羟化型的合成短刺小克银汉霉菌在甾体药物中间体羟化过程中的应用是一个新的研究领域,转化产物表征结果表明该菌株能将环氧黄体酮直接11β羟化,可一步实现甾体药物合成路线中11β羟化这一关键步骤。通过对培养基组成、转化工艺和投料方式优化,在投料浓度为2guf0d7L-1时,产物得率可达到43%,显示了较好的应用前景。但是,在实验研究过程中发现,该菌株的酶系比较复杂,环氧黄体酮转化后的产物除主要的11β羟化产物外,还有几种未知副产物存在,而且菌株每批次的转化能力不太稳定。此外,虽然相对于β羟化的其他菌株