铁皮石斛不同极性提取物体外抗氧化活性研究

铁皮石斛不同极性提取物体外抗氧化活性研究

自由基理论认为，体育性疾病、癌、炎症和免疫疾病与自由基代谢失衡有关。因此，如果体内自由基保持动态平衡，就可以对付由活性氧及其由此产生的脂质氧化引起的疾病。过氧化反应直接消除残余自由基，有效防止或减少体内自由基引起的氧化损伤，治疗与生育性氧气毒性有关的疾病。植物中的天然活性剂有效且无害，因此深受人们欢迎。因此，科学家多年来一直从具有抗逆性活性的植物中寻找阻力的物质基础，然后发现具有抗逆性活性的天然化合物。根据研究，天然化合物主要来源于植物的多酚和黄酮类。石斛是常用名贵中药材,为兰科(Orchidaeae)石斛属(Dendlvbium)多种植物的新鲜或干燥茎的统称.传统中医常将其用于滋阴清热、生津益胃、止咳润肺,现代药理研究表明石斛具有多种医药功效,可预防和治疗白内障、增强免疫功能、治疗肿瘤、降血糖、抗氧化等,在临床中应用相当广泛.目前我国76种石斛属植物中,有近40种被作为药用.其中铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)是药典明确收载的药用石斛之一,主要分布于我国西南和江南各省,是珍稀名贵药用石斛.研究表明,铁皮石斛主要含石斛多糖、生物碱、氨基酸、微量元素和菲类化合物等有效成分.有文献报道铁皮石斛中存在黄酮及多酚类化合物,但目前还未见其黄酮及多酚化合物的制备及相关生物活性的报道.因此我们拟在前人对铁皮石斛药用价值研究的基础上考察铁皮石斛不同极性提取物的抗氧化活性,并探讨其与多酚及黄酮含量的相关性,以期寻找铁皮石斛抗氧化活性的物质基础.1材料和方法1.1材料和试剂1.1.1仪器、设备和从物铁皮石斛购自云南普洱,于60℃下烘干备用.紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司),旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器),高速粉碎机(永康市久品工贸有限公司),电子分析天平(奥斯豪仪器有限公司),电热恒温水浴锅(上海越磁电子科技有限公司),台式高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司).1.2实验方法1.2.1残留液的提取新鲜铁皮石斛茎清洗、烘干、粉碎成粉末备用.取铁皮石斛茎粉末于400mL的烧杯中,加75%乙醇室温提取(3×200mL,每次6h).残渣加95%乙醇室温提取(3×400mL,每次6h).合并上述提取液,减压浓缩至浸膏状.标明EE.取部分样品(约总量的3/4)用85%乙醇溶解,氯仿萃取(3×100mL),氯仿层减压浓缩至少量,烘干,标明CE.将上述步骤中的残留液用乙酸乙酯萃取(3×100mL),乙酸乙酯层减压浓缩至少量,烘干,标明EAE.残留液继续加入正丁醇萃取(3×100mL),正丁醇层浓缩至少量,烘干,标明NBE.1.2.2标准曲线的绘制和测定没食子酸标准储备液:准确称取0.2500g没食子酸标准品,用少量蒸馏水溶解,定容于250mL容量瓶中,摇匀,其质量浓度为1.00mg/mL.没食子酸标准使用液:精密量取没食子酸标准储备液5.00mL于100mL容量瓶中,加水至标线,摇匀,其质量浓度为0.050mg/mL.精密量取没食子酸标准储备液1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mL于100mL容量瓶中,用蒸馏水定容,配成标准系列.分别吸取标准系列溶液1.00mL于比色管中,加入0.3mLFC试剂,混匀,再加入1.5mL7%碳酸钠溶液,加水定容至10mL,充分振摇,室温下静置20min.以试剂空白作参比,用1cm比色皿测定波长760nm处的吸光度.以测得的吸光度为纵坐标(y)、没食子酸溶液的质量浓度为横坐标(x,μg/mL)绘制标准曲线,得到线性回归方程.将样品配置成1.00mg/mL,吸取试样溶液1.00mL于比色管中,加入0.3mLFC试剂,混匀,再加入1.5mL饱和碳酸钠溶液,加水定容至10mL,充分振摇,室温下静置20min.以试剂空白作参比,用1cm比色皿测定波长760nm处的吸光度.根据测得的吸光度和标准曲线回归方程,计算样品中的多酚含量(以没食子酸计).1.2.3标准曲线a-c含量的测定精密称取芦丁对照品20mg,置100mL容量瓶中,加95%乙醇50mL使溶解,然后加50%乙醇稀释至刻度,即得0.2mg/mL的对照品溶液.精密量取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,分别置于10mL容量瓶中,各加50%乙醇溶液使成5mL,精密加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL,摇匀,放置6min,加入10%硝酸铝溶液0.3mL,摇匀,再放置6min,加入1mol/L氢氧化钠溶液4mL,分别用50%乙醇稀释至刻度,摇匀,放置15min.以第一瓶作空白,用可见分光光度计在510nm处测其吸收度,作A-C标准曲线(或计算其回归方程).精密量取提取液1mL,按上述标准曲线制备方法进行测定,并由标准曲线或回归方程计算样品中总黄酮的含量.1.2.4vc清除abts活性将各样品及Vc标准品配制成浓度为3000μg/mL、1500μg/mL、750μg/mL、375μg/mL、187.5μg/mL、93.75μg/mL、46.875μg/mL的样品液.分别取Vc及各样品液0.1mL,加入1mL的ABTS溶液(A734nm=0.70±0.02),充分混合,室温避光放置20min,用紫外分光光度计734nm处测定吸光度.空白对照用超纯水代替样品液,重复3次.按下式计算清除率:清除率=(A空白对照-A样品)/A空白对照×100%.其中,A为吸光度.1.2.5清除vc的制备将各样品及Vc标准品配制成浓度为3000μg/mL、1500μg/mL、750μg/mL、375μg/mL、187.5μg/mL、93.75μg/mL、46.875μg/mL的样品液.分别取Vc及各样品液0.3mL,加入0.9mL的DPPH甲醇溶液(0.1mmol/L),室温暗反应30min,紫外分光光度计517nm处测定吸光度.空白对照用超纯水代替样品液,重复3次.按下式计算清除率:清除率=(A空白对照-A样品)/A空白对照×100%.其中,A为吸光度.1.2.6清除总有机溶剂.将各样品及Vc标准品配制成浓度为3000μg/mL、1500μg/mL、750μg/mL、375μg/mL、187.5μg/mL、93.75μg/mL、46.875μg/mL的样品液.采用羟自由基试剂盒检测,紫外分光光度计550nm处测定吸光度.空白对照用超纯水代替样品液,重复3次.计算清除率.1.2.7样品溶液的制备将各样品及Vc标准品配制成浓度为3000μg/mL、1500μg/mL、750μg/mL、375μg/mL、187.5μg/mL、93.75μg/mL、46.875μg/mL的样品液.分别移取Vc标准品及各样品液0.5mL,加入磷酸盐PBS(pH6.6、0.2mol/L)2.5mL和30mmol/L铁氰化钾溶液2.5mL充分混合,50℃水浴20min.分别向各反应液加入2.5mL三氯乙酸(0.6mol/L)混合均匀.分别取上清液2.5mL,各加入2.5mL超纯水和0.5mL三氯化铁(6mmol/L),摇匀,紫外分光光度计700nm处测定其吸光度.空白对照用蒸馏水代替样品液,重复3次求平均值.2结果与分析2.1吸附过程中铁皮石斛总多酚和总黄酮含量的测定以没食子酸为标准对照,福林酚法测总多酚含量得标准曲线为y=9.2519x+0.0201(R2=0.9998).以芦丁为标准对照,测总黄酮含量得标准曲线y=1.0787x+0.0003(R2=0.9996).铁皮石斛各样品中总多酚和总黄酮含量结果见表1.从表1可知各样品总多酚含量规律为CE>EAE>NBE>EE,且CE的总黄酮含量最高,NBE最低.2.2abts清除效果样品和Vc对ABTS自由基的清除能力(图1A)呈现一定的浓度依赖性.其中样品CE浓度为375μg/mL,样品EE浓度为750μg/mL,样品EAE和样品NBE浓度均为1500μg/mL时,对ABTS自由基的清除率均能达到100%.样品清除ABTS的半抑制率从大到小为EAE>NBE>EE>CE.结果表明所有样品均对ABTS自由基有良好的清除能力,样品CE效果最佳,其IC50为88.82μg/mL(表2).2.3dpph自由基清除能力样品和Vc对DPPH自由基的清除能力(图1B)呈现一定的浓度依赖性,且各样品对DPPH自由基的清除能力大小为CE>EE>NBE>EAE,样品清除DPPH的半抑制率从大到小为CE>EE>NBE>EAE.其中CE的IC50最小为394.62μg/mL,EAE的IC50最大为1833.15μg/mL(表2).2.4eae的清除能力样品对羟自由基的清除能力呈现一定的浓度依赖性(图1C).在低浓度时,样品EAE对羟自由基的清除能力最强,超过阳性对照.随浓度增加,各样品的清除能力趋于平稳,而样品EAE的活性明显高于其他提取物,其IC50为714.19μg/mL,样品NBE的IC50最大为2102.91μg/mL(表2).2.5还原力测定各样品的还原结果(图2)显示,样品对羟自由基的清除能力呈现一定的浓度依赖性,而不同的样品对羟自由基的清除能力也不同,阳性对照Vc的还原能力明显大于各样品.各样品中CE的还原能力最强,在高浓度时,接近阳性对照,IC50为905.06μg/mL(表2).样品EE和NBE也表现出较强的还原力,其IC50分别为1498.07μg/mL和2567.17μg/mL(表2).而样品EAE还原力最弱.2.6还原能力与黄酮含量相关性4种提取物抗氧化活性与总酚含量和总黄酮含量之间的相关性(表3)显示,各提取物对ABTS、DPPH清除能力以及还原性与黄酮含量相关性较强,相关系数分别为0.845、0.902和0.994.羟自由基的清除能力与样品中的多酚含量明显相关,其相关系数为0.521,而与黄酮含量相关性较弱(相关系数为-0.156).各提取物的还原能力与其多酚含量也有一定相关性,其相关系数为0.600.而ABTS和DPPH自由基的清除与多酚含量相关性较弱.3复合提取物抗氧化活性的机制资料显示,植物中酚类化合物是一种天然抗氧化剂,其中多酚和黄酮中酚羟基结构中的邻位酚羟基很容易被氧化成醌类结构,同时对活性氧等自由基具有很强的捕捉能力,这使得多酚和黄酮具有较强的抗氧化性以及清除自由基的能力,且抗氧化活性的强弱与其所含多酚和黄酮类成分含量的高低具有较高的相关性.我们的实验结果表明,铁皮石斛各极性提取物均有一定的抗氧化活性,其中样品CE对ABTS、DPPH自由基清除效果最好,还原性最强,其IC50分别为88.82μg/mL、394.62μg/mL和905.06μg/mL.而样品EAE对羟自由基清除效果最好,其IC50为714.19μg/mL,其次是样品CE(IC50为1589.03μg/mL).通过相关性研究发现,各提取物抗氧化活性与总酚含量和总黄酮含量之间有明显的相关性,对ABTS、DPPH清除能力以及还原性与黄酮含量相关性较强,羟自由基的清除能力与样品中的多酚含量明显相关.即实验样品的抗氧化活性与多酚和黄酮含量均密切相关.这也充分证明了铁皮石斛抗氧化活性的物质基础可能就是多酚或黄酮,因此我们寻找铁皮石斛的抗氧化活性成分应从多酚或黄酮类成分着手.同时研究还发现不同的抗氧化体系与铁皮石斛中的多酚和黄酮相关性表现各异,这可能是由于铁皮石斛中多酚和黄酮的种类及结构不同所引起的.研究表明,植物酚类含量及种类与抗氧化活性强弱有关.如在多酚抗油脂氧化性实验中,有研究者发现表棓儿茶素棓酸酯>棓酸>表棓儿茶素>咖啡酸>表儿茶素>阿魏酸>鞣花酸.而在黄酮类化合物抗氧化活性强弱的研究中,有人发现黄酮结构中具有B-4’-OH时其抗氧化活性强于B环其他羟基基团,而C-3-OH基则无抗氧化性表现,同时C-2、3双键和A环OH基对黄酮的抗氧化活性也有较强的影响.而一些黄酮化合物如黄酮醇、黄酮、黄烷醇、异黄酮等,因