还原糖含量测定方法的比较

还原糖含量测定方法的比较

3、5-二硝酸（dns）的比色法是测定还原糖的常用方法。该方法具有简便、快速、灵敏度高等特点;同时,通过该方法测定还原力,还可以用于判断普鲁兰酶(pullulanase)等脱支酶对淀粉的脱支效果。但在采用该方法进行测定时,不同文献介绍的测定条件有较大差异,从而影响了测定结果的准确性和可比性。本实验对DNS比色法测定条件进行探讨,指出影响分析测定的关键因素,使测定结果更具准确性和可比性,以利于实际采用该方法进行相关分析测定时参考应用。1材料和方法1.1杰能科公司的纺粘设备玉米淀粉黑龙江龙凤玉米开发有限公司。普鲁兰酶(酶活1000ASPu/g)美国杰能科公司;3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、丙三醇、苯酚、亚硫酸钠、酒石酸钾钠、葡萄糖、醋酸钠、冰乙酸,以上药品为分析纯。1.2-型热电鼓风箱SP-721E型可见分光光度计上海光谱仪器有限公司;Acculab精密电子天平;702-型电热鼓风箱大连干燥箱厂;DZF-6050型真空干燥箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂;THZ-82A水浴恒温振荡器江苏荣华仪器制造有限公司;80-2离心机上海浦东物理光学仪器厂;HH-4数显恒温水浴锅国华电器有限公司。1.3方法1.3.1丙三醇溶液配制试剂1:称取3.25g3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中,移入500ml容量瓶,加2mol/L氢氧化钠溶液162.5ml,再加入22.5g丙三醇,摇匀,定容至500ml,储存于棕色瓶放置在冰箱中待用。试剂2:称取2.5g3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中,加入0.5g苯酚,再溶解0.075g亚硫酸钠、2.5g氢氧化钠和50g酒石酸钾钠,移入500ml容量瓶,摇匀,定容至500ml,储存于棕色瓶放置在冰箱中待用。1.3.2糖液的制备称取大于1g的葡萄糖置于热风干燥箱98℃干燥至恒重,准确称取1.000g葡萄糖,用蒸馏水溶解并定容至1000ml。分别按表1进行配置操作,充分混匀后于沸水浴中加热煮沸5min。流水冲冷却后再分别向各试管中加入蒸馏水4ml,混匀。以管1为空白对照,540nm波长下测各管的吸光度。绘制吸光度-葡萄糖浓度曲线。1.3.3乙酸钠缓冲溶液的制备A液:0.2mol/L乙酸溶液;B液:0.2mol/L乙酸钠溶液。按比例配制不同pH(4.0~5.0)缓冲液。1.3.4ds试剂加热取0.5ml葡萄糖标准液及0.5ml蒸馏水分别置于10ml试管中,再各加1.5mlDNS试剂,沸水浴加热5min,流水冷却,蒸馏水定容。将葡萄糖显色液-水(空白)、DNS试剂-水(空白)、葡萄糖显色液-DNS试剂(空白)分别在波长400~600nm范围内进行扫描。1.3.5ds试剂添加在准确加入0.5ml葡萄糖标准溶液的系列10ml试管中,分别加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml的DNS试剂,沸水浴加热5min,流水冷却、定容。以相同条件下不加葡萄糖标液作空白溶液,波长540nm下测定不同时间的吸光度。1.3.6ns试剂制备取葡萄糖标准液0.5ml及蒸馏水1ml于系列10ml试管中,分别加入DNS试剂,置沸水浴中加热、反应1、2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、30min取出,流水冷却,定容。以相同条件下不加葡萄糖标液作空白溶液,在波长540nm下测不同加热时间时溶液的吸光度。1.3.7ds试剂制备取10支管分别加入0.5ml葡萄糖标准溶液和1.5mlDNS试剂,混匀并作空白,沸水浴加热5min,流水冷却、定容。以相同条件下不加葡萄糖标液作空白溶液,波长540nm下测定吸光度。2结果与分析2.1最大吸收波长的确定DNS法即3,5-二硝基水杨酸比色法的测定原理是3,5-二硝基水杨酸在中性或偏碱性条件下与多糖水解的还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物——3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量和反应液的颜色呈正比。文献中关于DNS法的测定波长有540、520、490nm等各不相同,为了进一步确定DNS法在测定还原力过程中的最佳波长,考虑相关因素进行波谱扫描,结果如图1、2所示。在实验过程中,显色之前空白和待测液中DNS试剂的添加量是相同的,但显色期间由于部分DNS试剂与待测液中还原糖相结合,从而造成测定吸光度时,空白中DNS试剂含量大于待测液中DNS试剂含量。从图1可知,最大吸收峰处的波长为500nm。一般情况下,选取最大吸收峰处的波长进行测定可以提高灵敏度,但由图1可知,在此波长下DNS试剂也具有一定的吸光度(DNS试剂-水曲线)。再者,实验过程中,显色之前空白和待测液中DNS试剂的添加量是相同的,但显色期间由于部分DNS试剂与待测液中还原糖相结合,从而造成测定吸光度时,空白中DNS试剂含量大于待测液中DNS试剂含量。故500nm下,DNS试剂对测定结果干扰严重。结合葡萄糖显色液-水曲线可以看出,这种影响在λ<540nm的情况下一直很显著。故本实验DNS试剂1最终确定的测定波长选为540nm,而不是500nm(最大吸收波长)。同理,由图2可知,DNS试剂2最终确定的测定波长为550nm,而不是500nm(最大吸收波长)。2.2吸光度随时间的变化由图3可知,随着沸水浴加热时间的延长,吸光度变大,但两种试剂均在5min之后吸光度基本不变,说明显色反应基本完成,吸光度较稳定。故DNS试剂水浴加热时间在5min即可。2.3试剂用量的影响由图4、5可知,试剂用量和放置时间与吸光度值的关系,当DNS试剂用量小于1.5ml时,溶液吸光度随DNS试剂用量的增加而增大,试剂用量在1.5~2ml时,放置20min后吸光度值较稳定。试剂一的用量为2~3ml时吸光度值波动性较大。在实际测定中,两种试剂的加入量可采用1.5ml。2.4精密度实验由表4和表5可知,在本实验条件下DNS试剂1的精密度优于DNS试剂2。2.5标准曲线两种试剂的葡萄糖的标准曲线如图6所示。标准曲线表明,葡萄糖浓度在测定范围内显色灵敏、稳定且成良好线性。3最大吸收力量在碱性溶液中3,5-二硝基水杨酸被还原糖还原生成的氨基化