肝素对肝星状细胞增殖分泌的影响

肝素对肝星状细胞增殖分泌的影响

异常的细胞外基质（cem）的过度合成和积聚是肝纤维化发生和发展的主要病理过程。愈来愈多的证据表明,肝星状细胞被激活、数量增多,分泌大量胶原等ECM是肝纤维化形成的主要机制。自2002年以来,我们观察了肝素对肝纤维化大鼠肝星状细胞增殖及分泌的影响,旨在为肝纤维化的防治提供理论依据。1材料和方法1.1试剂与仪器Wistar雄性大鼠(山东省卫生防疫站提供),体重300～350g。四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、尼可登(Nycodenz),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、层粘连蛋白(LN)一抗(北京中山生物制品有限公司,SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),层流超净台、水平离心机、CO2培养箱、倒置相差显微镜、高压蒸汽消毒装置、酶标仪。1.2肝纤维化大鼠的检测普通杆状饲料喂养大鼠,自由进水,皮下注射40%CCl4花生油溶液(0.25ml/100g体重,首次加倍),每隔3d注射1次,共15次,即得肝纤维化大鼠。1.3mtt法测细胞生长应用Nycodenz一步密度梯度离心法分离肝纤维化大鼠的肝星状细胞。将纯度90%以上的新分离的肝星状细胞随机分为A、B、C三组,均悬浮在DMEM培养基中,A、B组培养液中分别加入1000和2000μg/ml肝素,按1×104/ml接种在96孔培养板中,每孔200μl,准备MTT法测细胞生长;另以2×104/ml接种在24孔培养板中,准备免疫细胞化学染色。1.4mtt法检测od采用MTT法。上述细胞培养7d左右,96孔培养板中的肝星状细胞呈对数生长时,0.4%胎牛血清同步化处理72h,每组设5个复孔,36.5℃、湿度96%、5%CO2的培养箱中培养2～3d,吸出培养液,0.05%(5mg/ml)的MTT200μl作用4h,吸出培养液后加入200μlDMSO并混匀,30min后用酶标仪测定570nm处的OD值。1.5sabc法检测tgf-1和ln的表达24孔培养板中的肝星状细胞经0.4%胎牛血清同步化处理72h,吸除上清,加DMEM1.5ml,每组设3个复孔,36.5℃、湿度96%、5%CO2的培养箱中培养2～3d,吸出培养液,应用SABC法检测α-SMA、TGF-β1和LN的表达。细胞质中有棕黄色染色颗粒沉积者为阳性,按照显色程度分弱、中、强,分别用+、++、+++表示。显色细胞数视野细胞总数<1/4为+,显色细胞数占视野细胞总数的1/4～1/2为++,显色细胞数占视野细胞总数的1/2～3/4为+++,显色细胞数>视野细胞总数的3/4为++++。每组计数5个视野,显色指数=显色程度×显色细胞比例。1.6统计方法采用SPSS10.0统计软件进行分析。组间比较应用t检验,检验水准为0.05。2结果2.1各组大鼠血清中p肝星状细胞OD值A组为0.0746±0.0131,B组为0.1106±0.0198,C组为0.0626±0.0137,A、B组均显著低于C组,P分别<0.01和<0.05;A、B组比较无显著差异(P>0.05)。2.2显示组的显色指数见表1。3肝星状细胞增殖肝星状细胞活化在肝纤维化形成中起重要作用。肝星状细胞在受到损伤刺激后发生表型转化,成为肌成纤维细胞样细胞(MFB),二者均表现为desmin染色阳性,但后者还表达α-SMA,可作为肝星状细胞活化的指标。肝星状细胞的活化受许多可溶性因子的作用调节,包括生长因子、细胞因子、化学介质、氧应激产物等等。TGF-β1是最强的促肝星状细胞纤维生成因子,具有强烈促肝星状细胞合成ECM的作用,并通过抑制基质金属蛋白酶(MMPs)合成、促进金属蛋白酶组织抑制物(TIMPs)及纤维蛋白溶解酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)生成而抑制ECM降解。肝星状细胞通过Ⅰ型受体(激活依赖Ⅱ型受体)促进ECM合成,通过Ⅱ型受体抑制细胞增殖,Ⅲ型受体(即β聚糖)无信号转导功能。静息状态的肝星状细胞仅表达Ⅱ、Ⅲ型受体,而激活的肝星状细胞三型受体均有表达,且随肝星状细胞的激活,Ⅰ型增多,Ⅱ型减少,此可能更有利于其产生ECM,同时使TGF-β1的增殖抑制作用减弱。LN是分子量较大的糖蛋白,能与Ⅳ型胶原、非胶原性糖蛋白及硫酸肝素等多种基质成分交联,并能自身交联,在基底膜的形成中发挥重要作用。Tanikawa报道,LN在正常肝窦不表达,而在慢性肝炎碎片状坏死灶和肝硬化纤维间隔附近的肝窦明显表达,肝硬化再生结节中的肝窦表达也增强。Castellot等于1985年提出,肝素在体外可抑制肾小球系膜细胞增生和分泌ECM。国内袁桃霞等发现肝素在体外可抑制肝星状细胞生长,并抑制其表达α-SMA、Ⅰ型及Ⅳ型前胶原;可减少肝星状细胞Ⅰ型胶原、纤连蛋白的合成。本研究显示,肝素可抑制体外培养的肝星状细胞增殖及其α-SMA和LN表达,说明肝素可抑制肝星状细胞活化,减少LN分泌;且剂量越大、抑制作用越强。DeBleser等研究发现,与正常大鼠肝脏的肝星状细胞相比,肝纤维化大鼠肝星状细胞中TGF-β1mRNA表达增加12倍,而TGF-β1表达增加可促进肝星状细胞合成ECM;正常大鼠肝脏中TGF-β1mRNA主要在枯否细胞内表达,内皮细胞未见表达。肝纤维化大鼠肝窦内皮细胞中均见TGF-β1mRNA强表达,提示肝窦内皮细胞亦在肝纤维化发生中起重要作用。本研究表明,肝素能够抑制肝星状细胞中TGF-β1的表达,此可能为其抑制肝星状细胞活化和分泌功能的机制之一。肝素是高度硫酸化的葡糖胺聚糖,硫酸乙酰肝素可在血管表面形成强大的负电荷,使血管内皮细胞表面的负电荷恢复正常,防止病毒、高胆固醇血症等对血管内皮细胞的损伤。我们以前的实验结果亦证实,慢性乙型肝炎患者血浆血管性假性血友病因子(vWF)水平升高;肝素可显著降低