高效液相色谱法-高效液相色谱法概念（仪器分析课件）

Contents目1高效液相色谱法简介2高效液相色谱法的特点3高效液相色谱法与气相色谱法的对比录仪器分析高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点仪器分析高效液相色谱法是一种色谱分离方法。高效液相色谱法是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入待测样品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器进行检测，从而实现对试样的定性分析或定量分析。高效液相色谱法的特点仪器分析高效液相色谱法已成为化学、生化、医学、工业、农业、环保、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术，是分析化学、生物化学和环境化学工作者手中必不可少的工具。同样能够实现多组分分离、检测分析手段，高效液相色谱法与气相色谱法的异同点各是什么？高效液相色谱法的特点仪器分析高效液相色谱法与气相色谱法的异同对比项目相同点不同点内容理论基础分析对象流动相操作条件塔板理论；速率理论种类、数量相态不同压力、柱温度不同高效液相色谱法的特点仪器分析分析对象气相色谱法适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差的样品和离子型及高聚物的样品，及大多数生化样品不可检测。高效液相色谱法适于溶解后能制成溶液的样品(包括有机介质溶液)，不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，可测有机物占有机物的80%以上。高效液相色谱法的特点仪器分析流动相气相色谱法流动相为惰性气体，且气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。高效液相色谱法流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。高效液相色谱法的特点仪器分析

操作条件对比项目柱温柱压柱效气相色谱法加温操作较HPLC低较HPLC低高效液相色谱法室温高压（液体粘度大，峰展宽小）高效：大于30000塔板/米；高灵敏：10-9g（紫外检测）、10-11g（荧光检测）高效液相色谱法的特点仪器分析

分离机理：气相色谱法依据吸附、分配两种原理进行样品分离，可供选用的固定相种类较多。高效液相色谱法可依据吸附、分配、筛析、离子交换、亲和等多种原理进行样品分离，可供选用的固定相种类繁多。Contents目1检测器的概述2检测器的种类3检测器的特点4检测器的应用及发展录仪器分析高效液相色谱法-检测器高效液相色谱法-检测器仪器分析HPLC分析不受温度和样品沸点、挥发性、热稳定性的限制，几乎所有的化合物包括高沸点、极性、离子型化合物和大分子物质均可用高效液相色谱法分析测定。因此具有更广阔的应用潜力。

高效液相色谱法在基础理论、仪器装置和色谱柱等方面的研究日趋成熟，已经成为化学、化工、环境、药学、食品等多个领域中最具优势的分离分析方法之一。

HPLC因其具有分析速度快、检测灵敏度好、能分析和分离高沸点且不能气化的热不稳定生理活性物质的特点而被广泛使用。HPLC的高效分离效果结合适宜的检测器，可以实现多种组分、物质的分析测定。尤其在生物化学、药学及临床分析中作为标准检测方法被收录于药典。EDCDMSDELSDED检测器仪器分析高效液相色谱法-检测器UVDRIDFD高效液相色谱法-检测器仪器分析HPLC检测器的作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的信号，常用检测器有：紫外可见吸收检测器（UVD）、荧光检测器（FD）、示差折光检测器（RID）、化学发光检测器（CD）、电化学检测器（ED）、质谱检测器（MSD）和蒸发光散射检测器（ELSD）等。一、紫外可见吸收检测器（ultraviolet－visibledetector，UVD）

紫外可见吸收检测器(UVD)是HPLC中应用最广泛的检测器之一，几乎所有的液相色谱仪都配有这种检测器。其特点是灵敏度较高，线性范围宽，噪声低，适用于梯度洗脱，对强吸收物质检测限可达1ng，检测后不破坏样品，可用于制备，并能与任何检测器串联使用。紫外可见检测器的工作原理与结构同一般分光光度计相似，实际上就是装有流动地的紫外可见光度计。高效液相色谱法-检测器仪器分析高效液相色谱法-检测器仪器分析二、荧光检测器(fluorescencedetector，FD)

荧光检测器是一种高灵敏度、有选择性的检测器，可检测能产生荧光的化合物。某些不发荧光的物质可通过化学衍生化生成荧光衍生物，再进行荧光检测。其最小检测浓度可达0.1ng／ml，适用于痕量分析；一般情况下荧光检测器的灵敏度比紫外检测器约高2个数量级，但其线性范围不如紫外检测器宽。

近年来，采用激光作为荧光检测器的光源而产生的激光诱导荧光检测器极大地增强了荧光检测的信噪比，因而具有很高的灵敏度，在痕量和超痕量分析中得到广泛应用。高效液相色谱法-检测器仪器分析高效液相色谱法-检测器仪器分析三、示差折光检测器（RID）示差折光检测器是一种浓度型通用检测器，对所有溶质都有响应，某些不能用选择性检测器检测的组分，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等，可用示差检测器检测。示差检测器是基于连续测定样品流路和参比流路之间折射率的变化来测定样品含量的。光从一种介质进入另一种介质时，由于两种物质的折射率不同就会产生折射。只要样品组分与流动相的折光指数不同，就可被检测，二者相差愈大，灵敏度愈高，在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓度成正比。高效液相色谱法-检测器仪器分析高效液相色谱法-检测器仪器分析四、

电化学检测器(elec)chemicaldetector，ED)

电化学检测器主要有安培、极谱、库仑、电位、电导等检测器，属选择性检测器，可检测具有电活性的化合物。目前它已在各种无机和有机阴阳离子、生物组织和体液的代谢物、食品添加剂、环境污染物、生化制品、农药及医药等的测定中获得了广泛的应用。其中，电导检测器在离子色谱中应用最多。电化学检测器的优点是：①灵敏度高，最小检测量一般为ng级，有目可达pg级；②选择性好，可测定大量非电活性物质中极痕量的电活性物质；③线性范围宽，一般为4～5个数量级；④设备简单，成本较低；⑤易于自动操作。

高效液相色谱法-检测器仪器分析高效液相色谱法-检测器仪器分析

五、化学发光检测器(c。iluminescencedetector，CD)

化学发光检测器是近年来发展起来的一种快速、灵敏的新型检测器，因其设备简单、价廉、线性范围宽等优点。其原理是基于某些物质在常温下进行化学反应，生成处于激发态势反应中间体或反应产物，当它们从激发态返回基态时，就发射出光子。由于物质激发态的能量是来自化学反应，故叫作化学发光。当分离组分从色谱柱中洗脱出来后，立即与适当的化学发光试剂混合，引起化学反应，导致发光物质产生辐射，其光强度与该物质的浓度成正比。

这种检测器不需要光源，也不需要复杂的光学系统，只要有恒流泵，将化学发光试剂以一定的流速泵入混合器中，使之与柱流出物迅速而又均匀地混合产生化学发光，通过光电倍增管将光信号变成电信号，就可进行检测。这种检测器的最小检出量可达10-12g。高效液相色谱法-检测器仪器分析高效液相色谱法-检测器仪器分析六、蒸发光散射检测器（ELSD）ELSD也是一种通用型的检测器，可检测挥发性低于流动相的任何样品，而不需要样品含有发色基团。ELSD的响应值与样品的质量成正比，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物。ELSD灵敏度比RID高，对温度变化不敏感，基线稳定，可用于梯度洗脱。现在ELSD已被广泛应用于碳水化合物、类脂、脂肪酸和氨基酸、药物以及聚合物等的检测。高效液相色谱法-检测器仪器分析高效液相色谱法-检测器仪器分析七、质谱检测器（MSD）

MSD是另一种通用型检测器，在灵敏度、选择性、通用性及化合物的分子量和结构信息的提供等方面都有突出的优点。但它的昂贵操作费用和复杂性限制了它的推广应用。高效液相色谱法-检测器仪器分析高效液相色谱法-检测器仪器分析光学类检测器：UVD、FD通用型检测器：RID、MSD、ELSD、ED、CDContents目1认识高效液相色谱法的特点2熟悉高效液相色谱的分类录项目4：头孢拉定分析

（高效液相色谱法定量分析）任务1：认识高效液相色谱法子任务1：认识高效液相色谱法的特点

以气体为流动相的色谱称为气相色谱；以液体为流动相的色谱称为液相色谱。高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC）色谱图子任务1：认识高效液相色谱法的特点

发展历史1903年俄国植物化学家茨维特（Tswett）首次提出“色谱法”（Chromatography）和“色谱图”（Chromatogram）的概念。他在论文中写到：“（原文）一植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管滤下，后用纯石油醚淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，就象光谱一样，称之为色谱图。”1930年以后，相继出现了纸色谱、离子交换色谱和薄层色谱等液相色谱技术。1952年，英国学者Martin和Synge基于他们在分配色谱方面的研究工作，提出了关于气－液分配色谱的比较完整的理论和方法。1960年中后期，气相色谱理论和实践发展，以及机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱又开始活跃。到60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了HPLC。子任务1：认识高效液相色谱法的特点

子任务1：认识高效液相色谱法的特点

高效液相色谱法（HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，随着现代科学技术的发展而发展起来的一种高效、高速、高灵敏度的分离方法。由于固定相和流动相的多样性，分离机理也是多种多样。从原理上讲，只要是能溶解在流动相中的物质都可以用高效液相色谱来分离和分析。

方法项目高效液相色谱法经典液相（柱）色谱法色谱柱：柱长/cm柱内径/mm10~252~1010~20010~50固定相粒度：粒径/um筛孔/目5~502500~30075~600200~30色谱柱入口压力/Mpa2~200.001~0.1色谱柱柱效/（理论塔板数/m）2×102~5×1042~50进样量/g10-6~10-21~10分析时间/h0.05~1.01~20特点：高压、高效、高速、高灵敏度、应用范围广（表4-6）

高沸点、对热不稳定、相对分子质量大的有机及生化试样的高效分离分析方法。子任务1：认识高效液相色谱法的特点

高效液相色谱仪装置示意图流动相石油醚混合色素叶绿素叶黄素胡萝卜素分离组分色谱柱固定相碳酸钙气相色谱法与高效液相色谱法异同点子任务1：认识高效液相色谱法的特点

气相色谱法与高效液相色谱法异同点子任务1：认识高效液相色谱法的特点

气相色谱法与高效液相色谱法异同点子任务1：认识高效液相色谱法的特点

相同点1.都是利用物质在流动向和固定相中分配系数不同而分离的。2.都根据色谱流出曲线的色谱峰位置（保留值）进行定性分析，根据色谱峰面积或峰高进行定量测定；根据色谱峰位置及其宽度，可以对色谱柱分离情况进行评价。3.进行定量分析都可用外标法、内标法及归一化法。4.色谱分离及色谱柱的分离效能可用塔板理论和速率理论进行解释。高效液相色谱按分离机理分类液固吸附色谱液液分配色谱键合相色谱凝胶色谱离子色谱子任务2：熟悉高效液相色谱的分类

一、液固吸附色谱1.分离原理组分在固定相吸附剂上的吸附作用不同进行分离与吸附剂结构和性质相似的组分易被吸附，保留时间长，后出峰；反之，与吸附剂结构和性质差异较大的组分不易被吸附，保留时间短，先出峰。子任务2：熟悉高效液相色谱的分类

应用：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有极性官能团的化合物和异构体有较高选择性；对同系物的选择性小，对不同族化合物具有好的选择分离能力。

2.固定相子任务2：熟悉高效液相色谱的分类

极性非极性硅胶、氧化铝、分子筛，；分离酸性物质，如酚类、羧酸活性碳、多孔石墨化炭黑（5-10μm），苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的单分散多孔微球固定相酸性吸附剂碱性吸附剂硅胶、硅酸镁；分离碱性物质，如胺类吸附剂结构类型薄壳型硅胶全多孔型硅胶直径为30～40μm的玻璃珠表面涂布一层1-2μm厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质快但柱容量有限。粒径为5～10μm的硅胶微粒，颗粒和孔径均一，柱容量大，为液固色谱固定相和键合固定相的主要基质。选择流动相原则：极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用极性弱的流动相。极性强度的表示方法：用溶剂强度参数

°表示。子任务2：熟悉高效液相色谱的分类

3.流动相°：每单位面积吸附剂表面溶剂的吸附能力。°越大，极性越大。（表4-9）为获得合适的溶剂极性，一般采用两种或两种以上不同极性的溶剂按一定比例混合后使用。一、液液分配色谱1.分离原理流动相：液相固定相：液相涂渍在惰性载体或硅胶上。组分在固定相和流动相上的分配，分配系数K大的组分，保留时间长，后出柱。子任务2：熟悉高效液相色谱的分类

对极性化合物和非极性化合物都能实现较好的分离效果。根据固定相和流动相的相对极性的不同分类子任务2：熟悉高效液相色谱的分类

（1）正相分配色谱法（normalphase）：固定相极性＞流动相极性（2）反相分配色谱法（reversephase）：固定相极性＜流动相极性固定相载体上涂布的是极性固定液，流动相为非极性溶剂，适用于极性化合物的分离，极性小的组分先流出，极性大的组分后流出。固定相载体上涂布的是极性较弱或非极性的固定液，流动相为极性较强的溶剂，适用于非极性化合物的分离，极性组分先流出，非极性组分后流出。组成惰性载体（担体）：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝固定液（表4-10）子任务2：熟悉高效液相色谱的分类

2.固定相正相分配色谱法的固定液反相分配色谱法的固定液β,β’-氧二丙腈乙二醇甲基硅酮1,2,3-三（2-氰乙氧基）丙烷乙二胺氰丙基硅酮聚乙二醇400,600二甲基亚砜聚烯烃甘油，丙二醇硝基甲烷正庚烷冰乙酸二甲基甲酰胺（DMF）防止固定液流失的办法子任务2：熟悉高效液相色谱的分类

（1）尽量选择对固定液仅有较低溶解度的溶剂作为流动相。（2）在分析柱前加一根预饱和柱。流动相进入色谱柱前，先通过预饱和柱，预先用固定液把流动相饱和。（3）使流动相保持低速经过固定相，并保持色谱柱温度稳定。（4）选择时若溶解样品的溶剂对固定液有较大的溶解度，应避免过大的进样量。3.流动相组成洗脱剂：溶解和分离试样调节剂：调节极性，改变组分在柱中的移动速度和分离状态子任务2：熟悉高效液相色谱的分类

正相分配色谱：流动相主体为低极性溶剂，可加入＜20%的极性改进剂反相分配色谱：流动相主体为水，可加入＜10%的改性剂流动相的选择原则（1）对试样有适当的溶解度，以防止在柱头产生沉淀。（2）与固定相互不相溶，不与试样发生化学反应。（3）应与所用检测器匹配。（4）黏度应较小，以获得较高的柱效。（5)纯度高，毒性小，价格便宜，不污染环境和腐蚀仪器。三、键合相色谱法键合相色谱：采用化学键合相的液相色谱法。键合固定相：利用化学反应将各种不同的有机基团以化学键的形式连接到载体表面的游离羟基上而制得。形成化学键合相的条件：一是载体表面应有某种活性基团；二是固定液应有与载体表面发生化学反应的官能团。子任务2：熟悉高效液相色谱的分类

分类正相键合色谱法：固定相极性＞流动相极性，分离极性与强极性化合物反相键合色谱法：固定相极性＜流动相极性，分离非极性、极性化合物等键合固定相应符合的条件（1）化学稳定性和热稳定性好，在使用中固定液不易流失。（2）在pH=2～8的溶液中不变质，选择性好，有利于梯度洗脱1.分离原理子任务2：熟悉高效液相色谱的分类

（1）正相键合相色谱分离原理（2）反相键合相色谱分离原理正相键合相色谱使用的是极性键合固定相[以极性有机基团如胺基、腈基、醚基等键合在硅胶表面制成]，溶质在此类固定相上的分离机理属于分配色谱。反相键合相色谱使用的是极性较小的键合固定相[以极性较小的基团如苯基、烷基等键合在硅胶表面制成]，分离机理可用疏溶剂作用解释。2.固定相基体：全多孔或薄壳型微粒硅胶分类：非极性、弱极性、极性（表4-11）子任务2：熟悉高效液相色谱的分类

非极性烷基键合相：应用最广泛的柱填料，C18反相键合相（ODS)，可完成高效液相色谱分析任务的70%～80%。3.流动相正相键合相色谱：采用与正相液-液分配色谱相似的流动相，主体为己烷（或庚烷）反相键合相色谱：采用与反相液-液分配色谱相似的流动相，主体为水，为改善分离的选择性常加入甲醇、乙腈、四氢呋喃等。甲醇-水体系应用较多。四、凝胶色谱法又称条件排阻色谱法或空间排阻色谱法。原理：基于分子大小不同进行分离的一种色谱分析方法。分子体积大先流出，分子体积越小，保留时间越长。固定相凝胶：化学惰性的多孔性凝胶。应用：分离、鉴定高分子聚合物。如研究聚合机理，选择聚合工艺及条件，并考察聚合材料在加工和使用过程中相对分子质量的变化。子任务2：熟悉高效液相色谱的分类

子任务2：熟悉高效液相色谱的分类

分析实例：总结

按分离机理分类高效液相色谱可分为液固吸附色谱、液液分配色谱、键合相色谱、凝胶色谱、离子色谱等。1.液固吸附色谱

（1）分离原理液固色谱是基于各组分吸附能力的差异进行混合物分离的（2）固定相吸附色谱固定相可分为极性和非极性两大类。极性固定相主要有硅胶（酸性）、氧化镁和硅酸镁分子筛（碱性）等。非极性固定相有高强度多孔微粒活性炭和多孔石墨化炭黑（3）流动相在液固色谱中，选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。流动相的极性强度可用溶剂强度参数ε°表示。ε°是指每单位面积吸附剂表面的溶剂的吸附能力，ε°越大，表明流动相的极性也越大。总结

2.液-液分配色谱（1）分离原理在液-液分配色谱中，一个液相作为流动相，另一个液相（即固定液）则分散在很细的惰性载体或硅胶上作为固定相。（2）固定相分配色谱固定相由两部分组成，一部分是惰性载体，另一部分是涂渍在惰性载体上的固定液。（3）流动相在正相分配色谱中，使用的流动相类似于液固色谱中使用极性吸附剂时应用的流动相。此时流动相主体为己烷、庚烷，可加入<20%的极性改性剂，如1-氯丁烷、异丙醚、二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、乙腈等。在反相分配色谱中，使用的流动相类似于液固色谱中使用非极性吸附剂时应用的流动相。此时流动相的主体为水，可加入一定量的改性剂，如二甲基亚砜、乙二醇、乙腈、甲醇、丙酮、对二氧六环、乙醇、四氢呋喃、异丙醇等。总结

3.键合相色谱法(1)分离原理①正相键合相色谱的分离原理正相键合相色谱使用的是极性键合固定相（以极性有机基团如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）等键合在硅胶表面制成的），溶质在此类固定相上的分离机理属于分配色谱。②反相键合相色谱的分离原理反相键合相色谱使用的是极性较小的键合固定相（以极性较小的有机基团如苯基、烷基等键合在硅胶表面制成的），其分离机理可用疏溶剂作用理论来解释。（2）固定相化学键合固定相广泛使用全多孔或薄壳型微粒硅胶做为基体。（3）流动相总结1.知识目标：高效液相色谱法与气相色谱、经典液相色谱的异同；高效液相色谱法的分类。2.能力目标：熟悉高效液相色谱法的应用领域。授课任务:分10个任务，10个组，每个组出一名同学进行授课，其他组员协助、补充，回答问题。1.熟悉高效液相色谱仪的工作流程（第一组）2.高压输液系统：（1）贮液器（第二组）（2）高压输液泵、过滤器（第三组）（3）梯度洗脱装置（第四组）3.进样系统（第五组）4.分离系统（第六组）5.检测系统:（1）HPLC检测器的要求，分类（第七组）（2）紫外-可见光检测器（第八组）（3）二极管阵列检测器、荧光检测器（第九组）（4）折光指数检测器、蒸发激光散射检测器（第十组）6.数据处理系统任务2：认识高效液相色谱仪

Contents目1熟悉高效液相色谱工作流程2熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用3学习高效液相色谱仪的使用录项目4：头孢拉定分析

（高效液相色谱法定量）任务2：认识高效液相色谱仪

子任务1：熟悉高效液相色谱工作流程

高效液相色谱仪结构示意图系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。子任务1：认识红外光谱仪工作流程高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至工作站记录、处理和保存。子任务2：熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用一、高压输液系统高压输液系统一般包括贮液器、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等。1．贮液器贮液器主要用来提供足够数量的符合要求的流动相以完成分析工作。过滤装置脱气装置材质：不锈钢、玻璃、聚四氟乙烯容积：0.5～2L溶剂：过滤、脱气子任务2：熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用2．高压输液泵主要部件之一，压力：150×105～350×105

Pa。作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱分离系统。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。高压输液泵子任务2：熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用高压泵分类色谱泵恒压泵恒流泵气动放大泵注射泵隔膜泵单柱塞泵双柱塞泵并联泵串联泵往复泵子任务2：熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用3.过滤器在高压输液泵的进口和它的出口与进样阀之间，应设置过滤器。高压输液泵的活塞和进样阀阀芯的机械加工精密度非常高，微小的机械杂质进入流动相，会导致上述部件的损坏，同时机械杂质在柱头的积累，会造成柱压升高，使色谱柱不能正常工作。过滤器的滤芯用不锈钢材料制成，孔径2～3μm，耐有机溶剂浸蚀，若发现过滤器堵塞（流量减小），可将其进入稀HNO3溶液中，在超声波清洗器中振动10～15min，即可将堵塞的固体杂质洗出。若清洗后仍达不到要求，则应更换滤芯。子任务2：熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用4.梯度洗脱装置定义：梯度洗脱也称溶剂程序，指一个样品在分离过程中，溶剂组分或溶剂强度随洗脱时间按一定规律连续变化的洗脱方式。高压梯度：只用于二元梯度低压梯度：一个高压输出泵子任务2：熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用特点：改善分离，加快分析速度；改善峰形，减少拖尾；可能引起基线漂移。下图显示了等度洗脱与梯度洗脱在分离度上造成的不同影响。子任务2：熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用二、进样系统

进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的装置，要求密封性好，死体积小，重复性好，进样引起色谱分离系统的压力和流量波动要很小。

1.六通阀进样器：进样体积由定量管（10L、20L）确定。操作步骤：阀柄置于Load，用平头微量注射器注入样品溶液，再将阀柄置于Inject，流动相与定量管接通，进入色谱柱。子任务2：熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用2.自动进样器自动进样器可实现批量进样。计算机自动控制定量阀、取样、进样、复位、清洗和样品盘转动等连续调节，进样重复性高，适合于大量样品的分析，节省人力，可实现自动化操作。子任务2：熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用三、分离系统组成：色谱柱、恒温装置、连接管。1.色谱柱（1）柱管：内径4.6mm、3.9mm，长10-50cm（2）固定相:5-10μm子任务2：熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用注意：色谱柱填充完毕后是有方向的，即流动相的方向应与柱的填充方向一致。色谱柱的管外都以箭头显著标示了该柱的使用方向，安装和更换色谱柱时一定要使流动相按箭头所指方向流动。2.色谱柱恒温装置提供柱温有利于增加样品在流动相中的溶解度，从而缩短分析时间；有利于改善传质过程，减少传质阻力，提高柱效；有利于降低流动相黏度，从而降低柱压。恒温装置：水浴式、电加热式、恒温箱式。柱温范围：室温-65℃。子任务2：熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用四、检测系统检测器：用于连续监测被测色谱系统分离后的柱流出物组成和含量变化的装置。作用：将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的信号，完成定性定量分析的任务。要求：灵敏度高、响应快、重现性好、线性范围宽、适用范围广、对流动相流量和温度波动不敏感、死体积小等特点。子任务2：熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用检测器分类检测器通用型检测器专用型检测器连续测量色谱柱流出物（流动相、样品）的全部特性变化，通常采用差分测量法。差折光检测器、电导检测器和蒸发光散射检测器适用范围广、但灵敏度低，易受温度和流量波动的影响，造成较大的漂移和噪声，不适合痕量分析和梯度洗脱。测量被分离样品组分某种特性的变化。紫外检测器、荧光检测器、安培检测器。灵敏高，对流动相流量和温度变化不敏感，可用于痕量分析和梯度洗脱。

a.紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。

特点：灵敏度高；线形范围宽；流通池可做得很小(1mm×10mm，容积5-8μL)；

对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。子任务2：熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用b.光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。子任务2：熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用子任务2：熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用C.荧光检测器

（Fluorescencedetector）高灵敏度，高选择性。对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。子任务2：熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用D.示差折光检测器

（Differentialrefractiveindexdetector）除紫外检测器之外应用最多的检测器。可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度成正比。

通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）。灵敏度低、对温度敏感，不能用于梯度洗脱。

偏转式、反射式和干涉型三种。子任务2：熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用子任务2：熟悉高效液相色谱仪组成和各部分作用五、数据处理系统（色谱工作站）HPLC的分析结果除可用记录仪绘制谱图外，现在广泛适用色谱数据处理机和色谱工作站来记录和处理色谱分析结果。子任务3：学习高效液相色谱仪的使用一、高效液相色谱分析操作过程样品的采集→样品的制备→标准样品溶液的制备→流动相的配制→色谱柱的安装和流动相的更换→开机→分析样品（包括进样、数据采集、定性分析、谱图优化和数据处理）→关机与结束工作。二、样品制备1．样品的采集样品的采集同气相色谱分析。2．样品的制备样品的制备同气相色谱分析。三、标准溶液的制备子任务3：学习高效液相色谱仪的使用四、流动相的配制五、色谱柱的安装和流动相的更换六、高效液相色谱的开机七、分析样品1、进样2、数据采集3、定性分析4、谱图优化和数据处理八、关机与结束工作总结知识目标：（1）高效液相色谱法仪工作流程；(2)高效液相色谱仪组成和各部分作用；（3）高效液相色谱仪的使用。能力目标：（1）熟悉高效液相色谱仪各部件及作用（2）熟悉高效液相色谱仪工作流程（3）会进行样品液制备，流动相配制、过滤、脱气、更换，色谱柱安装。（4）会操作仪器进行样品分析，数据处理。期末复习填空题1、电化学电池是

和

进行相互转换的电化学反应器，分为

和

两类。2、电位分析法中常用的指示电极有

和

两大类。3、原子吸收分光光度计主要由

、

、

、

等四部分组成。4、朗伯比尔定律可以写成

，应用时溶液浓度不宜超过

，且多组分测定时吸光度A具有

性。5、在中红外光区中，一般把4000～1330cm-1区域叫做

，而把13300～400cm-1区域叫做

。6、共轭作用或引入助色团可使紫外-可见吸收峰向长波方向移动，这种现象称为吸收峰

，使吸收峰向短波方向移动的现象称为

。

期末复习7、气相色谱分离系统主要由柱箱和色谱柱组成，其中

是

气相色谱仪的心脏，一般可分为

和

两类。8、傅里叶变换红外光谱仪是红外光谱仪的第

代，其核心部分是

。9、pH电极测定溶液前需要进行

操作，常选用的缓冲溶液有

、

、或

。10、红外吸收光谱产生的条件是

。11、根据固定相和流动相极性的不同，液液分配色谱可分为两类：

和

。12、红外光谱分析法，由于取代基的诱导效应，使得基团频率发生变化，随着取代基数目的增加或取代基电负性的增大，会导致基团振动频率向

移动。13、波数与波长的关系：

，中红外光区波数范围是

。期末复习判断题（

）1.pH电极是离子选择性电极，响应的是溶液中的H+。（

）2.膜电位产生的根本原因是离子交换和扩散。（

）3.吸光度和透射比的关系是A=lg(1/T)。（

）4.朗伯比尔定律应用前提是：单色光，均匀介质发生吸收，反应体系稳定且浓度在0.01mol/L以下。（

）5.光的波长在200-400nm属于紫外光区，在400-780nm属于可见光区。（

）6.互补的两束单色光按照一定强度比例混合可得到白光。（

）7.朗伯比尔定律作为光吸收基本定律，适用于溶液对光的吸收、气体或固体对光的吸收。（

）8.λmax对应的ε表明测定法的灵敏度。（

）9.当入射光为280nm时进行分光光度法测定时应使用石英比色皿。（

）10.常见的参比溶液包括：溶剂参比、试剂参比、试液参比、褪色参比。期末复习（

）11.色谱法按固定相形式可以分为柱色谱、薄层色谱、纸色谱等。（

）12.空心阴极灯中是充满了低压惰性气体。（

）13.半峰宽W1/2即为峰宽Wb的一半。（

）14.保留值是色谱定性分析的参数。（

）15.正相分配色谱的流动相极性大于固定相的极性。（

）16.气相色谱仪使用热导检测器时，为保证检测器有较高的灵敏度，应选用N2作载气。（

）17.气液色谱中选择固定液的原则是极性相同原理。（

）18.红外光谱法中由于共轭效应会使共轭体系的电子云密度平均化，结果使原来的双键伸长，力常数削弱，所以振动频率会升高。（

）19.普通酸度计通电后可以立即开始测量。（

）20.原子吸收光谱分析中，灯电流的选择原则是：在保证放电稳定和有适当光强输出的情况下，尽可能选用低的工作电流。（

）21.邻二氮菲分光光度法测定水中微量铁的试样中，参比溶液采用的是褪色参比。期末复习选择题1、电位滴定法是根据（

）来确定滴定终点的。A.指示剂颜色变化B.电极电位C.电位突跃D.电位大小2、评价气相色谱检测器的性能好坏的指标有（

）。A．基线噪声与漂移B.检测器体积的大小

C．检测器的线性范围D.灵敏度与检测限3、分子价电子在发生轨道跃迁时所需能量的大小顺序是（

）。A.σ→σ*＞π→π*＞n→σ*＞n→π*B.σ→σ*＞n→σ*＞π→π*＞n→π*C.σ→σ*＞π→π*＞n→π*＞n→σ*D.σ→σ*＞n→π*＞n→σ*＞π→π*4、某有色溶液的吸光度为0.300，则该溶液在同样比色皿厚度下的透光度为（）。

A.

30%

B.

50%

C.

70%

D.

10-0.30期末复习5、红外吸收光谱是

光谱，原子吸收光谱是

光谱。A.线状光谱，线状光谱B.带状光谱，带状光谱C.线状光谱，带状光谱D.带状光谱，线状光谱6、对气相色谱描述不正确的是()。A.以气体为流动相B.可分析气体、液体、固体试样C.对样品的气化温度无限制D.可与红外仪、质谱仪等联用7、俄国植物学家茨维特在研究植物色素的成分时所采用的色谱方法属于（

）。A.液固色谱B.液液色谱C.气固色谱D.气液色谱8、离子选择电极的电位选择性系数可用于（

）。A.

估计电极的检测限

B.

估计共存离子的干扰程度

C.

校正方法误差

D.

估计电极的线形响应范围9、影响摩尔吸光系数ε大小的是（

）。

A.

吸光物质的浓度

B.

吸收池的长度

C.

入射光波长

D.

入射光强度期末复习10、在多原子分子中，以下分子的振动形式中强度最大的是（

）。A.面内弯曲振动

B.面外弯曲振动

C.对称伸缩振动

D.不对称伸缩振动11、已知某待测水样的pH大约为5左右，定位溶液最好选（

）。A、pH4.00

和pH6.86

B、pH2.00

和pH6.86

C、pH6.86

和pH9.18

D、pH4.00

和pH9.1812、原子吸收分光光度法的干扰不包括()。A.光谱干扰B.电离干扰C.溶剂干扰D.物理干扰

13、使用原子吸收分光光度计测定

组分时应选择较窄狭缝。A.碱金属B.碱土金属C.稀土金属D.前三者均是14、色谱分离的基本理论不包括()A.塔板理论B.速率理论C.朗伯比尔定律D.前三者15、紫外吸收分光光度法中溶剂对测定可能产生的影响是（

）。A．共轭效应B．助色效应C．超共轭效应D．溶剂效应期末复习简答题1、介绍本学期学到的仪器分析常用的定量方法：方法内容、特点、适应性。2、气相色谱法定性分析常用方法有哪几种？写出具体内容。3、电极活化和色谱柱老化的目的各是什么？4、气相色谱法色谱柱温度的选择原则是什么？5、原子吸收分光光度法与紫外-可见分光光度法的异同点。6、影响朗伯-比尔吸收定律的因素有哪些？7、原子吸收分光光度法干扰及其消除方法。8、高效液相色谱法与气相色谱法的异同点。期末复习计算题1、当下列电池中的溶液是pH=4.00的缓冲溶液时，在25℃测定电池的电动势为0.209V：

玻璃电极丨H+（xmol/L）‖SCE

当缓冲溶液由未知溶液代替时，测定电池电动势如下：（1）0.312V；（2）-0.017V。试计算每种溶液的pH。2、SCE作负极，氟电极作正极，置于0.0010mol/L的氟离子溶液中，测得E=-0.159V，换用含氟离子试液，测定E=-0.218V，计算试液中氟离子浓度。期末复习3、使用一根理论塔板数n为6400的色谱柱分离某混合物。由色谱图上测得组分A的tRA为14min40s，组分B的tRB为15min，峰宽WbA、WbB分别为44s、45s。试计算：（1）组分A和B的分离度；能否完全分离？（2）假如A和B的保留时间不变，欲达到基本完全分离，所需的有效塔板数是多少？

在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和100秒，要达到完全分离，即R=1.5。计算需要多少块有效塔板。若填充柱的塔板高度为0.1cm，柱长是多少？解：r21=100/85=1.18

n有效=16R2[r21/(r21—1)]2

=16×1.52×(1.18/0.18)2=1547（块）L有效=n有效·H有效

=1547×0.1=155cm=1.55m

即柱长为1.55m时，两组分可以得到完全分离。

在一定条件下，两个组分的保留时间分别为12.2s和12.8s，计算分离度（柱长1m，n=3600）

。要达到完全分离，即R=1.5，所需要的柱长。解：分离度：子任务4：认识分离度——色谱柱的总分离效能指标

Contents目1认识常用的定性定量方法2头孢拉定定量分析录子任务1：认识常用的定性定量方法一、定性方法——标准对照法定性与气相色谱法的定性分析类似。二、定量方法——外标法子任务1：认识常用的定性定量方法1.方法首先用欲测组分的标准样品绘制标准曲线。具体方法是：用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与待测组分相同的色谱条件下，等体积准确进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准曲线，此标准曲线应是通过原点的直线。若标准曲线不通过原点，则说明存在系统误差。标准曲线的斜率即为绝对校正因子。在测定样品中的组分含量时，要用与绘制标准曲线完全相同的色谱条件作出色谱图，测量色谱峰面积或峰高，然后根据峰面积和峰高在标准曲线上直接查出注入色谱柱中样品组分的浓度。子任务1：认识常用的定性定量方法2.特点标准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。标准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。子任务2：头孢拉定定量分析学习情境（药典）色谱条件与系统适用性实验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，水-甲醇-3.86%醋酸钠溶液-4%醋酸溶液（1565：400：30：6）为流动相，流速为每分钟0.7~0.9mL，检测波长为254nm。取头孢拉定对照品溶液10份和头孢氨苄对照品贮备液（0.4mg/mL）1份。混匀，量取10μL注入液相色谱仪测定。头孢拉定峰和头孢氨苄峰的分离度应不小于2.0，计算数次进样结果，其相对标准差（RSD）不得过2.0%。理论板数按头