色谱分析-果汁中糖精钠含量测定

项目2.3果汁中糖精钠含量测定模块2：色谱分析任务引入市质量局术监督局，为保证食品安全，对部分超市出售的果汁进行抽查，欲检测其中糖精钠含量是否超标，设计一可行的分析方案。分析检测人员按照检测标准和规范化操作要求，完成糖精钠含量测定并提交检测报告。★高效液相色谱仪的基本构造及使用方法；★样品预处理技术；★定性定量方法任务分析完成果汁中糖精钠含量的测定，需要具备的基本知识和基本技能任务资讯

制定检测方案

决策计划

实施样品检测任务实施

任务检查评价

检查评价获取相关知识糖精钠含量测定

高效液相色谱仪的主要构造有哪些？任务资讯液相色谱定义以气体为流动相气相色谱法(GC)气固色谱法(GSC)气液色谱法(GLC)以固体为固定相以液体为固定相？以液体为流动相液相色谱法(LC)液固色谱法(LSC)液液色谱法(LLC)以固体为固定相以液体为固定相？液相色谱法分析流程高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至工作站记录、处理和保存。任务资讯高压输液系统贮液器材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK）容积：0.5～2.0L放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压差注意：密封、过滤任务资讯高压输液系统高压输液泵要求：泵体材料能耐化学腐蚀；能在高压（30～60MPa）下连续工作；输出流量稳定（±1%），无脉冲，重复性高（±0.5%），而且输出流量范围宽；适用于梯度洗脱。类型：一般可分为恒压泵和恒流泵两大类任务资讯高压输液系统流动相过滤与脱气装置流动相过滤装置分为在线过滤和真空过滤流动相脱气装置分为在线真空脱气和超声波脱气任务资讯六通阀进样器：用于固定体积进样进样系统六通阀进样示意图任务资讯任务资讯进样系统液相色谱进样针：类似于气相色谱进样针，只是其针头为平头，以免扎破六通阀管路。用于可变体积进样自动进样器任务资讯分离系统色谱柱分离系统的主要部件是色谱柱，柱效高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的一般要求。安装和更换色谱柱时一定要使流动相能按箭头所指方向流动。一般在色谱柱前要求安装保护柱，起到保护延长分析柱寿命的作用。有些物质的分离条件要求有一定的温度，因此，给色谱柱配一个柱温箱是非常有必要的。任务资讯检测系统解：分类通用型：示差折光检测器（RID）、电导检测器（ECD）和蒸发光检测器（ELSD）,它们检测物质总体物理性质的变化情况专用型：紫外检测器（UV-Vis）、荧光检测器（FD)，它们检测某一物理或化学性质的变化任务资讯紫外-可见光检测器任务资讯荧光检测器任务资讯示差折光检测器任务资讯电导检测器任务资讯数据处理系统（工作站）打开工作站，选择工作通道编辑方法文件，设置方法名称、运行时间及定量方法输入路径名、样品名、操作者等样品分离完成后，记录谱图文件名和色谱峰峰高、峰面积和保留值等任务资讯高效液相色谱仪如何操作？如何维护？任务资讯操作过程演示1配制流动相把二次蒸馏水和色谱纯级甲醇以15：85的比例混合取混合均匀的溶液，经0.45µm的有机膜过滤，再脱气15分钟即可任务资讯操作过程演示2更换色谱柱把流动相贮液器放置在略高于高压泵的位置，插入带有不锈钢滤芯的输液管开启高压泵电源开关，打开排放阀设置流动相比例和流速等参数任务资讯揿下高压泵启动鍵“ON/OFF”，再按“Purge”鍵，仪器开始清洗高压泵和排除管路中的气泡。观察废液出口，若没有气泡，按“Purge”鍵，停止排放，关闭排放阀。打开检测器电源开关，设置检测波长操作过程演示3任务资讯待仪器运行平衡后，用液相进样针进样，一般为定量管的3~5倍的体积。工作站对所注射样品进行分析测试，并绘制分离色谱图。色谱工作站对测试数据进行计算，并将结果在屏幕上显示出来操作过程演示4任务资讯仪器维护仪器的性能影响到分析的结果，因此，我们要及时维护仪器。贮液器流动相在使用前都应用0.45μm的滤膜过滤，以保持贮液器的清洁；要定期清洗贮液器，以防滋长微生物。高压输液泵所用流动相或溶剂均过滤和脱气；开泵时应放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液；不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中进样器进样前应使样品混合均匀，无可溶解的污染物，以免堵塞六通阀；液相进样针应为平头针；每次工作结束后应冲洗整个系统；以防止缓冲盐和其它残留物留在进样系统中。任务资讯色谱柱①在进样阀后加流路过滤器（0.5μm烧结不锈钢片），挡住来源于样品和进样阀垫圈的微粒。②在流路过滤器和分析柱之间加上“保护柱”，收集阻塞柱进口的来自样品的降低柱效能的化学“垃圾”。③色谱柱应在要求的pH值范围和柱温范围下使用，应使用不损坏柱的流动相。④进样前应将样品进行必要的净化，以免进样后对色谱柱造成损伤。⑤每次工作结束后，如果流动相是水和有机溶剂系列，则用流动相冲洗30分钟左右；如果流动相中含有盐溶液，则先用水-甲醇（90∶10）然后再用纯甲醇冲洗20分钟并保存。仪器维护任务资讯分析中的污染一般检测的环境、容器、试剂都是影响测定结果的因素。容器实验室常用的器皿有玻璃类、瓷类、石英类、塑料类等，在进行分析时，应按照待测样品的要求来选则器皿，不管使用哪种器皿，容器的洗条清洁都是很重要的，也是取得好的检测结果的基本保证。试剂在液相色谱分析中，所选用的试剂必须是色谱纯、优级纯或分析纯，如果用含量有杂质的试剂，则会出现杂峰而影响测定结果。环境污染仪器室的有害气体、气溶液、灰尘等等都能造成污染，影响检测结果，这种污染很难校正。因此，仪器室与其他实验室应隔离，保持清洁，仪器室内应安装空调，注意防潮、防腐、防震、空气相对湿度应小于70%为宜任务资讯如何对样品进行预处理？任务资讯样品的预处理技术样品预处理的目的是消除基质干扰，保护仪器，提高方法的准确度、精密度、选择性和灵敏度。预处理的过程一般包括：提取经典的方法有均质提取法、振荡提取法、索氏提取法等。净化比较传统的净化手段有液液萃取和固相萃取等，目前比较先进、实用的处理技术凝胶渗透色谱、基质固相分散技术、分子印记技术等也得到了比较广泛的应用。浓缩常见减压蒸馏和气流吹蒸两种方式任务资讯样品的预处理技术(续）衍生化所谓衍生化，就是将用通常检测方法不能直接检测或检测灵敏度比较低的物质与某种试剂（即衍生化试剂）反应，使之生成易于检测的化合物。按衍生化的方法可以分为柱前衍生化和柱后衍生化。按生成衍生物的类型又可分为紫外-可见光衍生化、荧光衍生化、拉曼衍生化和电化学衍化。衍生化技术不仅使高效液相色谱分析体系复杂化，而且需要消耗时间，增加分析成本，有的衍生化反应还需要控制严格的反应条件。因此，只有在找不到方便而灵敏的检测方法，或为了提高分离和检测的选择性时才考虑用衍生化技术。

任务资讯如何进行定性定量分析？任务资讯定性方法问题：如何对样品进行定性分析？利用已知标准样品定性联系气相色谱法的定性利用检测器的选择性定性当某一被测化合物同时被两种或两种以上检测器检测时，两检测器或几个检测器对被测化合物检测灵敏度比值是与被测化合物的性质密切相关的。

利用紫外检测器全波长扫描功能定性全波长扫描紫外检测器检测化合物的紫外光谱图。再通过对照标准谱图的方法来识别化合物。任务资讯定量方法问题：如何对样品进行定量分析？面积归一化法外标法内标法标准加入法任务资讯归一化法定量练习用高效液相色谱法测定吲哚二羧酸中主成分的含量，已知在分析条件下所有组分都出峰，且分离完全，根据测定数据计算吲哚羧酸中主成分（出峰时间在5.7min左右）的含量。序号12345保留时间/min3.543.964.825.727.15峰面积/mV•min762011694460553251064372解：任务资讯外标法定量外标法的特点：操作、计算简单，是一种常用的定量方法。它无需各组分都被检出、洗脱。但需要标样，标样及未知样品的测定条件要一致，进样体积要准确。任务资讯外标法实例用液相色谱法测定叶酸片（5mg/片）中叶酸含量。称取对照品5mg，加30ml0.5%氨水溶解，用水定容至50mL，20uL进样得叶酸峰面积为92800；另取已研成粉末的叶酸片剂91.5mg，同法测定得叶酸峰面积为91750，求叶酸片剂的百分含量。（已知平均片重为92.2mg）解：查阅资料◆GB/T5009.28-2003食品中糖精钠的测定◆GB2760-2011食品安全国家标准食品添加剂使用标准◆GB/T603化学试剂◆GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法决策计划果汁中糖精钠含量的测定步骤决策计划1.流动相的预处理2.标准溶液的配制3.样品处理4.色谱柱的安装和流动相的更换色谱参考条件①柱：YWG-C184.6mm×250mm10μm不锈钢柱。②流动相：甲醇：乙酸铵溶液(0.02mol·L-1)(5+95).③流速：1mL/min。④检测器：紫外检测器，230nm波长，0.2AUFS。5测定取处理液和标准使用液各10μL(或相同体积)注入高效液相色谱仪进行分离，以其标准溶液峰的保留时间为依据进行定性，以其峰面积求出样液中被测物质的含量，供计算。6、测定记录与结果质检员准备检测用仪器任务实施高效液相色谱仪（紫外检测器）；C18不锈钢填充柱（柱长250mm，内径4.6mm）；色谱工作站；抽滤装置（0.45μm滤膜）分类名称规格数量名称规格数量小组共用分析天平1台微量注射器10μL1支容量瓶3只移液管10mL1支质检员准备检测用试剂任务实施名称甲醇乙酸铵氨水糖精钠果汁规格GRARARGR样品数据处理计算公式任务实施测定标准样的保留时间（进样标记至色谱峰顶尖的时间），以此为依据进行定性分析。根据样品中糖精钠色谱峰的峰面积，计算各饮料种中糖精钠的含量。■仪器规范使用方面■数据记录、计算方面■结果准确度、精密度方面■误差原因分析检查与评价

液相色谱是如何完成混合物的分离？

混合物中各组分在固定相和流动相之间会发生吸附、溶解或其他亲和作用，这种作用存在差异，从而使各组分在色谱柱中的迁移速度不同得到分离石油醚碳酸钙颗粒色素玻璃柱任务引领下的知识拓展与深化

固定相将特定的液态物质涂于担体表面化学键合于担体表面而形成的有机键合层如C18（十八烷基硅烷）、C8（辛烷基）、氨基键合硅胶固定相类型极性固定相：正相色谱(固定相极性>

流动相极性)以极性有机基团如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）等键合在硅胶表面制成的非极性固定相：反相色谱(固定相极性<流动相极性)反相色谱法最常用的固定相是C18、C8和苯基键合相的填料，在分离极性很大的化合物时，也可以采用氨基、氰基等极性基团键合固定相。液液分配色谱任务引领下的知识拓展与深化

使用条件为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值，但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8）。太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。键合相色谱—固定相特点使用过程中不流失均一性和化学稳定性好重现性好分离效率高适于梯度洗脱传质阻抗小任务引领下的知识拓展与深化

反相色谱常见流动相流动相洗脱强度顺序：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氢呋喃<丙醇<二氯甲烷（与水不混溶）若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相，可用于分离极性化合物若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等常见固定相反相色谱法最常用的固定相是C18、C8和苯基键合相的填料，在分离极性很大的化合物时，也可以采用氨基、氰基等极性基团键合固定相。任务引领下的知识拓展与深化

疏溶剂理论：当溶质分子进入极性流动相后,即占据流动相中相应的空间，而排挤一部分溶剂分子；当溶质分子被流动相推动和固定相接触时，溶质分子的非极性部分或非极性分子）会将非极性固定相上附着的溶剂膜排挤开，直接和非极性固定相上的烷基官能团相结合（吸附）形成缔合物，构成单分子吸附层；当流动相极性减小时，这种疏溶剂斥力下降，会发生解缔，并把溶质分子释放而被洗脱下来反相色谱法的分离机理1任务引领下的知识拓展与深化

影响溶质保留的三个主要因素：溶质分子中非极性部分的总表面积溶质和固定相接触的总表面积愈大，保留值愈大，所以溶质的极性愈弱，疏水性越强，保留值越大。键合相上的烷基总面积烷基键合固定相的作用在于提供非极性的作用表面。随着碳链的加长，烷基的疏水特性增强，溶质的保留值也随烷基碳链长度的增加而增大。流动相的表面张力流动相的表面张力愈大，介电常数愈大，极性亦愈强；溶质和烷基键合相的缔合作用愈强，流动相的洗脱强度弱，导致溶质的保留值大。反相键合相色谱法的分离机理2任务引领下的知识拓展与深化

时间，min固定相：C1固定相：C8固定相：C181-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯例：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。分离机理实例任务引领下的知识拓展与深化

正相色谱法反相色谱法1.极性固定相

聚乙二醇、氨基与腈基键合相2.相对非极性流动相

正已烷、环已烷

3.极性调节剂

乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷4.分离中等极性和极性较强化合物.

酚类、胺类、羰基类及氨基酸类

5.组分流出顺序

极性小先洗出1.非极性固定相

C18（简称ODS）、C82.极性流动相

水或缓冲液3.极性调节剂

甲醇、乙腈、四氢呋喃4.分离非极性和极性较弱化合物

占整个HPLC应用的80%左右5.组分流出顺序

极性大先洗出液液分配色谱任务引领下的知识拓展与深化

其他类型色谱法按分离机制分类：液固吸附色谱法离子色谱法凝胶色谱法（分子排阻色谱法）

（空间排阻色谱法）其他类型色谱法任务引领下的知识拓展与深化

液固吸附色谱法固定相：吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5-10μm流动相：有机溶剂适用于分离分子量200-1000的组分，大多数用于非离子型化合物的分离，常用于分离同分异构体。液固吸附色谱各组分的出峰顺序极性较小组分，吸附力较弱，容易解吸，先流出。极性较大组分滞留作用大，后流出。饱和烃<烯<芳烃<醚<醛酮<酸任务引领下的知识拓展与深化

吸附脱附再吸附再脱附…分离过程是一个吸附－脱附的平衡过程。液固吸附色谱分离机理任务引领下的知识拓展与深化

氯化噻吩嗪四种异构体的分离色谱图氯化噻吩嗪四种异构体的分离异构体具有不同的空间排列方式，因此吸附剂对它们的吸附能力有所不同，从而得到了分离。液固吸附色谱实例任务引领下的知识拓展与深化

固定相:离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基阳离子交换树脂在表面未端芳环上接上季胺基阴离子交换树脂流动相：电解质溶液、有机弱酸或有机弱酸盐溶液离子交换色谱法ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－任务引领下的知识拓展与深化

油田水质中的阴离子分析固定相：薄壳型阴离子交换树脂(3×250mm)流动相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1

Na2CO3离子色谱法实例任务引领下的知识拓展与深化

分离原理树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换而分离。应用离子交换色谱法主要用于分析阴，阳离子，凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。分析物质有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

离子交换色谱法任务引领下的知识拓展与深化

以凝胶(gel)为固定相。它类似于分子筛，但凝胶的孔径比分子筛要大得多。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。凝胶色谱分离示意图

凝胶色谱：（分子排阻色谱法）分离机理凝胶色谱分离机理任务引领下的知识拓展与深化

凝胶色谱（分子排阻色谱法）油田用驱油剂聚丙烯酰胺损失量的测定色谱柱：150mm×46mm固定相：二醇基键合相，孔径200A，粒径5um流动相:甲醇/0.05mol/LNaH2PO4凝胶色谱法实例1-聚丙烯酰胺2-原油+石油磺酸盐+氯化钠任务引领下的知识拓展与深化

建立一个HPLC方法了解样品的基本情况主要包括样品所含化合物的数目、种类（官能团）、分子量、pKa值、UV光谱图以及样品基体的性质（溶剂、填充物等）、化合物在有关样品中的浓度范围、样品的溶解度等。明确分离目的明确分离是为了定性还是定量；是单组分还是多组分分析；定量的精密度要求有多高；本实验室现有的实验条件是什么等等。任务引领下的知识拓展与深化

了解样品的性质和需要的预处理高效液相色谱分离前均需进行某种形式的预处理。检测器的选择不同的分离目的对检测的要求不同，应尽量使用紫外检测器（UV），因为目前一般的HPLC都配有这类检测器，它方便且受外界影响小。如被测化合物没有足够的UV生色团，则应考虑使用其他检测手段。建立一个HPLC方法（续）任务引领下的知识拓展与深化

在高效液相色谱法作为分离方法中，有80%的物质的分离依靠反相色谱来完成。在反相色谱中，水是常用的流动相弱组分，C18是常用的填充载体，重要的是选择流动相的强组分，常用的强组分有甲醇、乙腈与四氢呋喃。分离模式的选择建立一