食品酶学第三章课件

第三章

酶的别离和纯化技术本章重点各种别离方法的操作原理别离方法的应用原那么酶别离纯化中应注意的问题酶制剂的来源

解决问题？如何提高酶的回收率和纯度质量Purpose？获得一定量的、不含有或少含杂质的酶制剂或者提纯为结晶，以利于在工业生产或科学研究中应用

建立一个可靠和快速的检测酶活与纯度的方法，并对整个别离过程中每一步始终贯穿酶活力的测定。了解所别离酶的结构与性质特点以及酶在细胞中的存在状态。明确原料的特性与数量。了解各种方法的原理特性和优缺点并选择有效的别离纯化方法。各种方法的使用顺序安排合理。时刻防止酶的变性，操作要在温和或低温的条件下进行。要充分考虑到介质与溶液体系中各种因子的影响和实际的实验条件。考虑因素本章主要内容第一节酶的别离纯化程度第二节酶的抽提第三节酶溶液的浓缩第四节酶的别离提取第五节酶的纯化第六节酶的提纯标准表3－1从E.coli中别离、纯化天冬酰胺酶步骤总蛋白含量/mg总活力×107U比活力/U.mg-1

回收率％提纯倍数匀浆1.4×10828.621001酒精粗沉淀4.1×10614.3355017.540℃调pH4.59.5×10511.41204060上清液DEAE纤维素柱6.5×1059.01403270CM纤维素柱层析3.0×1056.020021100结晶2.2×1054.822017110重结晶1.7×1053.822017110从表3－1可知，随着别离、纯化过程，酶的比活力越来越高，提纯程度越来越高，其提纯倍数也越来越大，而其总活力、回收率相对降低。一般试剂级及药品级酶纯度要求高，那么采取提纯倍数高的方法。工业用酶对纯度要求较低，其本钱价格显得重要，甚至有时采用粗酶液。而食品级酶在整个别离、纯化工程中要注意卫生、防止污染，各方面均须综合考虑。本章主要内容第一节酶的别离纯化程度第二节酶的抽提第三节酶溶液的浓缩第四节酶的别离提取第五节酶的纯化第六节酶的提纯标准第二节酶的提取一、酶原料的选择二、酶源材料的预处理三、酶的抽提一、酶原料的选择1.遵循的原那么酶含量多、干扰物少；来源丰富、保持新鲜；容易得到、提取工艺简单；稳定性好、平安性好；有综合利用价值等。例如：提取生姜蛋白酶应该以姜的根部为原料，提取淀粉酶那么应以培养的微生物为原料。2.注意的问题1〕酶存在胞内酶和胞外酶之分，一般而言，胞内酶比胞外酶难于提取。2〕材料不同，同一材料不同部位或不同生长期，酶的含量不相同。如：脂肪氧化酶在大豆中的含量是在花生中含量的100倍。3〕同一种酶在动物材料、植物材料、微生物材料中性质不同，平安性也不同。4〕选择到适宜的材料后应及时使用，防止酶的破坏。5〕植物材料具有一些不利于酶提取的因素，如含有较高的纤维素、色素和单宁；细胞不易破碎；液泡中代谢物复杂等。6〕动物脏器中含有较多的脂肪，容易氧化酸败导致原料变质，影响纯化操作和酶的得率。7〕微生物具有种类多、繁殖快、培养简便、诱变容易和不受季节地点影响等优点，并且可以通过微生物培养方法富集诱导酶，因此已成为制备酶的主要材料之一。8〕采集的材料在正式进行酶的提取之前，一般都要进行一定的前处理，去除明显可见的杂质和干扰物质。二、酶源材料的预处理〔胞内酶〕机械破碎法物理方法酶解法外表活性剂处理法丙酮粉法机械破碎法包括研磨法和细菌磨法研磨法细菌磨法——此法比研磨法省力，其破碎率也比研磨法效率高。

细菌磨结构示意图物理方法超声波破碎法

渗透压法

冻融法根本原理是利用超声波〔10-15KHz〕的机械振动而使细胞破碎。由于超声波发生时的空化作用，致使液体形成局部减压引起液体内部产生很大的压力导致细胞破碎。先将细胞置于高渗溶液〔如蔗糖溶液〕中平衡一段时间后，突然将其转入到低渗缓冲液和水溶液中，细胞壁会因为渗透压的突然变化而破碎。将细胞在低温〔-15℃〕下冰冻后在在室温下溶化，如此反复屡次就能使细胞壁破裂。此法也只适用于细胞壁易破的细胞。冻融过程要迅速，不能很长时间〔速冻速溶〕酶解法用外源的溶菌酶或细胞壁分解酶〔如蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等〕在一定条件下作用于细胞而使细胞壁破碎。例如：用酶法破碎酵母细胞时，需要先参加蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构；甘露糖酶可以专一的水解细胞壁上的甘露糖，使得细胞壁的结构破坏。另外再参加葡聚糖酶作用于葡聚糖层。最后改变渗透压使细胞膜破裂，胞内物质溶出。外表活性剂处理法在适当的温度、pH值及低离子强度下，外表活性剂〔如SDS、Tween、TritonX〕能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。此法对膜结合的酶的提取是相当有效的，但对其它蛋白质那么易使之变性，甚至切断肽链。丙酮粉法丙酮粉法的原理是利用丙酮能使细胞迅速脱水并破坏细胞壁的作用。具体操作：细胞离心收集菌体参加冷却的丙酮液搅拌抽滤反复用冷丙酮液洗涤置枯燥器中低温保存。经丙酮处理的细胞干粉称为丙酮粉。丙酮还能除去细胞膜局部脂肪，更利于酶的提取。三、酶的抽提What？在酶的别离纯化前期，将经过处理或破坏的细胞置于一定溶液中，使被提取的目的酶与其它物质别离的过程，包括酶与细胞固体残渣的别离、酶与其他物质的别离。酶在细胞中结合状态和溶解程度不同水溶法有机溶剂法〔一〕水溶法大局部酶或蛋白质能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中，其中稀盐和缓冲液对酶稳定性好、溶解度大。注意：1.盐浓度〔即离子强度〕2.pH值3.温度4.防止蛋白酶或核酸酶的降解作用5.搅拌与氧化盐浓度绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中参加少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶〞现象。为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中参加蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度〔如参加KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4〕可以增加溶液的极性。pH值蛋白质、酶的溶解度和稳定性与pH值有关。过酸、过碱应尽量防止，一般控制在pH=6～8范围内。提取溶剂的pH值应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。温度

为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在0℃～5℃的低温操作。防止酶的作用参加抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶的降解作用。

搅拌与氧化

搅拌能促使被提取物的溶解，一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。因为一般蛋白质都含有相当数量的-SH，假设提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使-SH氧化为二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中参加少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化。〔二〕有机溶剂法一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的酶难溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂进行提取。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或局部互溶，同时具有亲水性和亲脂性。

例如：植物种子中的酶——70%-80%乙醇提取；动物细胞微粒体、线粒体中存在的酶——正丁醇提取，因为正丁醇亲脂性强，可提高酶的溶解度。分配定律的定义——在恒温、恒压和比较稀的浓度下，某一溶质在两个不相混合的液相中的浓度分配比是一个常数，即为下式：〔C1/C2〕恒温、恒压=K

C1——表示分配到达平衡后溶质在上层有机相中的浓度C2——表示分配到达平衡后溶质在下层水相中的浓度K——为分配常数，不同溶质在不同溶剂体系中有不同的K值。

从上式可知，K值越大，那么在上层有机相中溶解度越大；反之，K值越小，那么在下层水相中溶解度越大。如果混合物中各组分k值彼此接近时，那么需要不断更换新的溶剂系统，通过屡次抽提便可把各种物质别离。本章主要内容第一节酶的别离纯化程度第二节酶的抽提第三节酶溶液的浓缩第四节酶的别离提取第五节酶的纯化第六节酶的提纯标准第三节酶溶液的浓缩

一、真空薄膜浓缩二、冷冻枯燥技术三、超滤技术四、透析技术一、真空薄膜浓缩是把酶溶液置于高度真空条件下成为薄层液膜，增大其蒸发面积到达加速蒸发过程的目的。优点：此法由于在真空条件下，可以大大降低热对酶分子的作用，减少其热变性失活。例如：XJT9503高温中性蛋白酶的制备工艺：采用加热真空薄膜浓缩，在40℃，-0.094～-0.096MPa真空度下，经过45～55min薄膜浓缩，可使发酵处理液浓缩2～3倍，其酶活力仅损失10%左右。二、冷冻枯燥技术定义：冷冻枯燥就是把含有大量水分的物质，预先进行降温冻结成固体。然后在真空的条件下使水蒸汽直接从固体中升华出来，而物质本身留在冻结的冰架子中，从而使得枯燥制品不失原有的固体骨架结构，保持物料原有的形态，且制品复水性极好。对冻干制品的质量要求是：生物活性不变、外观色泽均匀、形态饱满、结构牢固、溶解速度快，剩余水分低。冻干工艺包括预冻、升华和再干冻三个分阶段。适用范围：冰冻枯燥特别适用于那些对热敏感、易吸湿、易氧化及溶剂蒸发时易产生泡沫而引起变性的生物大分子，如蛋白质、酶、核酸、抗菌素和激素等。冷冻枯燥技术冷冻枯燥技术本卷须知1.样品溶液：①样品要溶于水，不含有机溶剂，否那么会造成冰点降低。②样品要予先脱盐，不可使盐浓度过高，否那么冰冻后易融化，影响样品活性，而且不易冻干。③样品缓冲液在冰冻时pH可能会有较大变化，此时需参加pH稳定剂，如糖类和钙离子等。④样品溶液的浓度不要过稀，例如蛋白质的浓度不低于15mg/mL为宜。2.装样品溶液的容器①最好用各种尺寸的培养皿盛样品溶液，液层不要太厚，以免冻干时间太长。也可以使用安培瓶和青霉素小瓶。②冻干稀溶液时会得到很轻的绒毛状固体样品，容易飞散而损失和造成污染，因而要用刺了孔的薄膜或吸水纸包住杯口。3.溶液冰冻尽可能用干冰～乙醇低温浴速冻，如能将盛有样品溶液的容器边冻边旋转形成很薄的冰冻层，那么可以大大加快冻干的速度。4.冻干①样品全部冻干前，不要轻易摇动，以防水蒸汽冲散冻干的样品粉末。②样品冻干到达较高真空度时，容器外部有时会结霜，假设外霜消失，那么说明样品已冻干。③冻干后要及时取出样品，以免样品在室温下停留时间过长而失活。④关真空泵时要先放气，以免泵油倒灌。放气时要缓慢，以免气流冲散样品干粉。⑤样品冻干后要及时密封冷藏，以防受潮。⑥真空泵要经常检查油面和油色，通常半年或一季度至少要换一次油。三、超滤技术1.定义：超滤过程是利用膜的筛分机理，在加压条件下，把酶溶液通过一层只允许水分子和小分子物质选择性透过的微孔超滤膜，而酶等大分子那么被截留，从而到达浓缩酶液的目的。超滤膜是具有特定的均匀孔径和孔隙的多孔薄膜。

表3-2“Diaflo〞超滤膜的物理特性膜代号截留酶的分子质量/U近似平均孔径/nmXM-30030000014XM-1001000005.5XM-50500003PM-30300002.2PM-20200001.8PM-10100001.5UM-210001.2UM-0.550012.超滤膜的材料醋酸纤维素、各种芳香聚酰胺、聚砜和聚丙烯腈-聚氯乙烯共聚物。3.超滤膜主要形式

折叠平板式、管壳式、螺旋式和中空纤维管式

四种主要超滤膜(1)折叠平板式(2)管壳式(3)螺旋式(4)中空纤维管式1.折叠平板式膜可制成平面滤板，板内形成折叠以增加过滤面积，提高液流的湍动程度，降低浓差极化，此型式装置结构简单，膜面积可达1500m2，易于清洗，易更换，其缺点是过滤面积的扩大会受到限制。2.管壳式超滤装置是使待处理的酶溶液在管内流动，溶剂及低分子溶质透过管壁会聚后排出。

3.螺旋式主要装置是螺旋卷，是将膜、支撑材料、膜、间隔材料依次迭好，围绕一中心管卷紧，形成一个膜组，料液在膜外表通过间隔材料，沿轴向流动，使待处理酶液在管内错流呈螺旋路线。4.中空纤维管式目前常用的是中空纤维超滤膜。内径为0.5-1mm左右，酶溶液从管内流过，溶剂和低分子溶质可透过管壁集中后流出。这种装置过滤面积大，过滤面积高达3000m2/m3。表3-3中空纤维超滤装置特性型号25SIP-3013HF53-20-PM10HF30-20-PM10HF15-43-PM10中空纤维内径/mm0.80.50.51.1公司分析相对分子质量6000100001000010000超滤器外径/mm890760760760超滤器长度/mm11921092635635超滤有效面积/m24.74.92.81.4允许使用压强/Mpa3.02.71.752.7最高使用温度/℃80757575持液量/ml—625340405SIP为旭化成公司产品，使用细胞色素C为标准物；而HF为Amicon公司产品，使用白蛋白为标准物。四、透析技术透析是利用半透膜的选择性在溶液里别离大分子和小分子的一种别离技术。常常用于除去蛋白或核酸样品中的盐、变性剂、复原剂之类的小分子杂质。样品在膜的一边，缓冲液在另一边，小分子即向两边扩散直到平衡，而大分子那么由于半透膜的阻拦而留在一端，通过不断更换缓冲液，即可将样品中要除掉的小分子稀释到足够低的浓度。本章主要内容第一节酶的别离纯化程度第二节酶的抽提第三节酶溶液的浓缩第四节酶的别离提取第五节酶的纯化第六节酶的提纯标准一、胞外酶〔蛋白酶为例〕的别离提取工艺流程蛋白质的别离提纯工艺流程二、胞内酶〔酰胺酶〕的别离提纯工艺流程酰胺酶的别离提取工艺流程图三、木瓜蛋白酶的提取工艺木瓜蛋白酶是利用未成熟的番木瓜果实表皮的白色乳汁，提炼而成的一种蛋白水解酶。它是由212个aa组成，分子量为21000，属于含巯基〔-SH〕肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性。已被广泛应用于食品、美容化装品、医药保健品、饲料等多个行业。未成熟番木瓜→人工取乳液→参加抗氧化剂→过滤陈杂→压滤→下一步提纯(120目钢质筛)。本章主要内容第一节酶的别离纯化程度第二节酶的抽提第三节酶溶液的浓缩第四节酶的别离提取第五节酶的纯化第六节酶的提纯标准第五节酶的纯化一、根据酶溶解度不同的纯化方法二、根据酶分子大小、形状不同的纯化方法三、根据酶分子电荷性质的纯化方法四、根据酶分子专一性结合的纯化方法一、根据溶解度不同方法—沉淀法定义——溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。根本原理——是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而到达别离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关。在酶制备中最常用的几种沉淀方法：1.盐析法

2.有机溶剂沉淀3.选择性沉淀4.等电点沉淀5.有机聚合物沉淀盐析法〔1〕定义在溶液中参加中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析〞。〔2〕优点①本钱低，不需要特别昂贵的设备。②操作简单、平安。③对许多生物活性物质具有稳定作用。〔3〕盐析法沉淀蛋白质的根本原理蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子外表极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以参加大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。〔4〕中性盐的选择常用的中性盐中最重要的是〔NH4〕2SO4。优点：1)溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。2)别离效果好：有的提取液参加适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了4倍。3)不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。4)价格廉价，废液不污染环境。〔5〕枯草杆菌α–淀粉酶与杂质酶(如蛋白酶)的盐析沉淀举例

分段盐析曲线

W1浓度可除去大局部杂蛋白，此时目的酶很少沉淀析出，沉淀物别离后再加—定量盐析剂至W2，此时，目的酶已根本沉淀析出，而杂蛋白很少混进目的酶中。有机溶剂沉淀法

〔1〕根本原理①降低水溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。②由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。〔2〕沉淀能力一般有机溶剂的沉淀能力依次为丙酮>异丙醇>乙醇>甲醇。在食品级酶制剂生产中采用乙醇较多，特别是生产食品级酶制剂时对卫生要求有保证。〔3〕有机溶剂的用量常采用相当于酶液二倍体积的有机溶剂沉淀酶蛋白，在分段沉淀时，有机溶剂的最适浓度也应通过实验来确定。如果采用逐步提高有机溶剂浓度，它的用量可按公式计算：V=V0(S2-S1)/(S-S2)式中V和V0——分别为参加的有机溶剂体积和原溶液的体积；S、S1、S2——分别为待加的有机溶剂、原来溶液中含有的有机溶剂和溶液要到达的有机溶剂质量分数。〔4〕优缺点优点是分辨率高，溶剂易除去，适于食品级和药品级酶提纯。缺点是有机溶剂会破坏蛋白质的氢键，易引起变性失活，所以特别要注意搅拌均匀，尽可能减少其变性失活。〔5〕本卷须知：1〕酶沉淀别离后，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度，防止变性。2〕该法沉淀析出的酶一般比盐析法析出的容易过滤或离心别离，但有机溶剂沉淀法易使酶变性，所以操作必须在低温条件下进行。3〕添加0.05mol/l的中性盐可以减少有机溶剂引起的酶变性，并可以提高酶的别离效果。4〕有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用，即操作时溶液的pH应控制在欲别离酶的等电点附近。选择性变性沉淀法

这一方法是利用生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到别离提纯。1〕热变性利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使非目的生物大分子变性沉淀而保存目的物在溶液中。2〕外表活性剂和有机溶剂变性那些对外表活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀。3〕选择性酸碱变性利用对pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀。等电点沉淀法

根本原理：蛋白质、酶是两性电解质，在等电点时溶解度最低，而且不同的酶和蛋白质具有不同的等电点。因此可以采用一定的措施使提取液的酸碱度到达某种酶或蛋白质的等电点，使其沉淀与其他物质分开，最终到达别离纯化酶的效果。此法主要用于在别离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。有机聚合物沉淀法〔液—液双水相抽提法〕根本原理是根据一种或一种以上亲水性聚合物水溶液的不相溶性，细胞碎片、多糖、酯类、核酸及酶的性质不同，在两相分配系数不同，因而到达别离目的。分配系数K=CT/CB式中K——分配系数CT——上相酶浓度(活力)CB——下相酶浓度(活力)K是由聚合物浓度、pH、离子强度、温度及被别离物质的量决定的。双水相的形成：两种不同水溶性聚合物浓度到达一定值时，体系会自然地分成互不相容的两相，构成双水相体系。每一水相中均有很高的含水量，为酶等生物物质提供了一个良好的环境；其中应用最多的是聚乙二醇(polyethyleneglycol简写PEG)[HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4)]，它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为6000～20000的PEG。几种典型的双水相系统聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖聚乙二醇（PEG）葡聚糖（Dex）硫酸葡聚糖钠盐聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖钠盐甲基纤维素聚乙二醇（PEG）磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁几种典型的双水相萃取酶蛋白实例酶菌种相系统延胡索酸酶Brevibacteriumsp.PEG/盐天冬氨酸酶E.coli

PEG/盐β-半乳糖苷酶E.coli

PEG/盐亮氨酸脱氢酶Bacillussp.PEG/Dex乙醇脱氢酶Baker’syeastPEG/盐青霉素酰化酶

E.coli

PEG/盐萃取实例保依地尼假丝酵母菌(Candidaboidinii)发酵产生的甲酸脱氢酶经四次连续抽提获得总收率为70％，纯度≥70％的产品。别离提纯甲酸脱氢酶：1一发酵罐发酵酶液2一喷嘴式别离器收集菌体3一玻璃珠破碎细胞4一热变性5一第一次液—液双水相抽提去除细胞碎片等物质6一喷嘴式别离器收集两相7一第二次液—液双水相抽提去除核酸、多糖及某些蛋白质8一第三次液—液双水相抽提为进一步提纯甲酸脱氢酶9一第四次液—液双水相抽提为甲酸脱氢酶转入上相10一酶产品，在4℃可稳定几个月本卷须知：A.酶的分子量越大其被沉淀下来所需要的PEG浓度越低。B.酶浓度高，易沉淀，但别离效果差，因此提取液中酶的浓度以小于10mg/ml为好。C.PEG的聚合度越高，沉淀酶时所需要的浓度越低，但别离效果差，一般常用的是PEG2000-6000。D.PEG对酶有一定的保护作用，因此该方法可以在常温操作。E.溶液的pH越接近酶的pI越易沉淀。F.溶液的离子强度要适宜，一般离子强度小于2对PEG沉淀效果的影响不大。G.沉淀后有机聚合物容易去除。二、根据酶分子大小、形状不同的纯化方法

1.离心别离技术2.透析与超过滤技术3.过滤4.凝胶层析技术离心别离技术〔1〕根本原理借助离心机旋转时所产生的离心力，而使分子大小、形状不同的物质别离开来。〔2〕分类普通离心机最大转速<8000r/min，相对离心力RCF<1×104g高速离心机最大转速<2.5×104r/min，相对离心力RCF<1×105g超速离心机最大转速>2.5×104r/min，相对离心力RCF>〔1-5〕×105g

透析与超过滤技术

透析与超过滤技术是利用具有特定大小、均匀孔径的透析膜或超滤膜的筛分机理，在不加压或加压的条件下把酶提取液通过一层只允许水和小分子物质选择性透过的透析膜或超滤膜，酶等大分子物质那么被截留，从而到达把小分子物质从酶提取液中除去〔透析与超过滤〕或同时到达浓缩酶液的目的〔超过滤〕。超过滤技术需要具有加压系统的超滤仪，而透析技术那么不需要专一的仪器。超滤柱提纯大分子物质示意图压力：6.9×104~6.9×105Pa膜材料主要有：玻璃纸、再生纤维素、聚酰胺、聚砜等。各种膜别离技术的特点过滤

在酶的别离中，常需要用过滤法从悬浮液中除去固体材料。小规模过滤是澄清溶液的好方法。使用助滤剂如C盐可改善过滤速度，C盐是硅藻土材料，主要由二氧化硅组成。密理博〔Millipore〕公司开发出可进行大规模过滤的一种膜过滤片，这种过滤是强迫悬浮液颗粒总是处在膜上面，而液体在压力下可通过膜，所以悬浮液中的颗粒浓度越来越浓。凝胶层析技术

原理：凝胶渗透色谱法(GelPermeationChromatography，简称GPC法)，又称为分子筛层析法。其原理主要是利用具有网状结构的凝胶分子筛的作用，根据被别离物分子大小不同而别离。待别离系统中小分子物质直径比凝胶孔径小，可渗入凝胶微孔中，产生阻滞作用大、流程长、移动速度慢，最后流出；而大分子由于阻滞作用小，流程短，移动速度快，先流出。凝胶过滤原理示意图

Kd=(Ve–V0)/Vi式中Ve——洗脱液体积V0——凝胶间空隙体积Vi——颗粒内部微孔体积Kd——分配系数，也就是溶质分子大小的一个函数。当Kd=1，即Ve=V0+Vi，说明该组分可进入微孔而最后流出。当Kd=0~1之间，Kd值小的先流出，大的后流出。Ve、V0、Vi可以通过实验测定。该法常用凝胶交联葡聚糖凝胶〔Sephadex〕交联琼脂糖凝胶(Sepharose)

聚丙烯酰胺凝胶

交联葡聚糖凝胶(Sephadex)

凝胶是以葡聚糖凝胶为原料，交联剂为环氧氯丙烷，在碱性条件下制成三维空间网状结构Sephadex。目前市售SephadexG10至G200共有8种。G表示凝胶保水值，单位为ml／g干胶，G后面的数字代表凝胶吸水量的10倍。例：G-25表示每克干胶膨胀时吸水2.5ml，G-200表示每克干胶吸水20ml。Sephadex是一种化学性质比较稳定的基质，不溶于水、盐、弱酸、碱。对热稳定，在中性条件下，湿态凝胶于110℃高温灭菌40min，性能与结构不变，而干态凝胶可耐受120℃的高温。交联琼脂糖凝胶(Sepharose)琼脂糖是从天然琼脂中别离制备的链状多糖，琼脂糖凝胶内部具有较大的网孔，工作范围较大，主要用于别离相对分子质量超过40万的样品。琼脂糖的商品名因生产厂家不同而异，瑞典的商品名为Sepharose；美国的为Bio-GelA；英国的为Segavac；丹麦的为Gelarose。

琼脂糖凝胶具有良好的惰性，不带电荷，在层析中，对生物大分子几乎无非专一性吸附，对盐酸胍和尿素等变性剂有很强的抵抗力，但是对温度不稳定。Sepharose的使用温度为0-40℃，pH稳定范围4-9。Sepharose有三种型号：Sepharose2B、4B和6B，数字表示凝胶中干胶的百分含量。从2B到6B，琼脂糖浓度逐渐增加，筛孔逐渐减小，机械强度依次增大。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺与交联剂N，Nˊ—甲叉双丙烯酰胺聚合而成的网状高分子物质。以商品名Bio-GelP-为例，P-后的数字乘以1000，表示该种凝胶可应用于别离蛋白质的最高分子质量，P后面的数字越大，越适合于大分子的别离。该凝胶不溶于水和普通的有机溶剂，对浓盐、盐酸胍及尿素有抵抗力，pH值稳定范围为2-11。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性、透明、有较好的热稳定性和化学稳定性，是一种非离子型凝胶，故在酶和蛋白质纯化中得到广泛应用。同时，上述凝胶层析法还用于去除热原物质和制造无离子水，应用于脱盐、高分子溶液的浓缩等。凝胶过滤层析法主要采用柱层析的方式。

柱层析操作过程包括：层析介质的平衡、膨润；装柱；加样；护展以及流出液成分的检测和分部收集。凝胶层析的效果通常以洗脱曲线表示，以流出液中的蛋白质浓度(如A280)或酶活性相对洗脱(液)体积(Ve)的图形表示。分辨率可用RS权衡，RS=两峰之间距离／峰宽，当RS=1.2时，通常认为已到达别离效果。

凝胶过滤层析洗脱曲线峰带：1-Po；2-Ald；3-BSA；4-OVA；5-CTogen；6-RNasA

三、根据酶分子电荷性质的纯化方法〔一〕离子交换层析〔二〕电泳离子交换层析

离子交换层析是采用离子交换剂作为固定相，洗脱溶液为流动相的一种层析方法。在溶液中，溶质离子由于静电引力的作用，可结合到离子交换剂的功能基团上，同时置换出功能基团上的反离子，使之进入流动相。交换过程如下式所用：RA+B+——RB+A+离子交换剂指含有解离性离子交换基团的高分子化合物，有两局部组成：一局部是大分子聚合物基质主体结构，一局部是具有荷电活性的功能基团。根据离子交换剂所含功能团的酸碱性，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两大类。根据交换剂的基质性质，可分为离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶三种。阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电。可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反响。根据电荷集团的强弱，又可将阳离子交换剂分为强酸型和弱酸型两种。其作用原理可表示如下：阴离子交换剂的电荷基团带正电，反离子带负电。可以与溶液中的负电荷化合物或阴离子进行交换反响。根据电荷集团的强弱，又可将阴离子交换剂分为强碱型和弱碱型两种。其作用原理可表示如下：

离子交换层析之所以能成功地把各种无机离子、有机离子或生物大分子物质分开，其主要依据是离子交换剂对各种离子或离子化合物有不同的结合力。蛋白质、多肽等两性物质当pH<pI时，它们所带正电荷能与阳离子交换剂结合；当pH>pI时，它们所带负电荷能与阴离子交换剂结合。根据基质性质1〕离子交换树脂：树脂是人工合成的疏水性物质，如聚苯乙烯、聚苯酚磺酸、聚丙烯酸等。离子交换树脂的颗粒大小以目表示，目数越大表示树脂越细。2〕离子交换纤维素：由纤维素作主体结构，纤维素上的OH基团被功能基团取代而形成的，属于亲水型离子交换剂。离子交换纤维素一般为白色，适用于生物大分子的别离纯化。3〕离子交换凝胶离子交换凝胶与离子交换纤维素相同，属于亲水型离子交换剂。它是以具有三维空间网状结构的葡聚糖或交联琼脂糖为基质，接入离子交换功能基团而制成的。离子交换凝胶兼有分子筛和离子交换两种功能，有较高的电荷密度，其总交换量比离子交换纤维素大。但缺乏之处：当洗脱液的pH值和离子强度改变时，大局部离子交换凝胶的基质体积会发生较大的变化，造成柱体积压紧、流速降低。三、根据酶分子电荷性质的纯化方法〔一〕离子交换层析〔二〕电泳电泳1、定义——带电颗粒在电场中向电荷方向相反的电极移动的现象称为电泳〔electrophoresis，EP〕。2、分类依据别离的原理可分为自由界面电泳、区带电泳、等速电泳、免疫电泳、毛细管电泳、印迹转移电泳；依据支持物的类型可分为醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等；依据电场的强度可分为高压电泳和常压电泳；依据电泳的方式还可分为单向电泳和双向电泳。在酶别离纯化中最广泛应用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳。与其他凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶有以下优点：1〕在一定浓度下，凝胶透明、有弹性、机械性能好2〕化学性能稳定、与被别离物不发生化学反响3〕对pH和温度变化较稳定4〕几乎