绿色荧光蛋白(GFP)技术在细胞生物学研究中的应用

绿色荧光蛋白(GFP)技术在细胞生物学研究中的应用

荧光现象在许多海洋无脊椎动物中普遍存在着。许多刺胞亚门的动物和几乎所有栉水母类的动物在受到刺激时都可以发出荧光：刺胞亚门的动物多发射绿色荧光，而栉水母类发射蓝色荧光。绿色萤光蛋白(greenfluorescentprotein)，简称GFP，它的发现和应用被称为细胞生物学上的一次革命。这种蛋白质结构很特殊，在受到蓝光或紫外线刺激时可以发射绿色荧光，并不需要任何协同因子、底物，适合用作普遍的报告标记，尤其适合于活体细胞或组织。由于GFP稳定、灵敏度高、无生物毒性、荧光反应不需要任何外源反应底物及表达无物种或细胞组织的专一性,检测简单，结果真实可靠，是一种独特的报告蛋白(Reporterprotein)。可广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等研究领域。图1绿色荧光蛋白1962年Shimomura和Johnson等人[1]首先从一种水母类动物AequoreaVictoria中分离纯化出了GFP,1992年Prasher[2]等克隆了GFP基因的cDNA并分析了GFP的一级结构,1994年M.Chalfie[3]等最早用重组野生GFP型基因做报告基因,成功地在原核和真核生物中得到表达。90年代后,人们对GFP的性质和应用进行了不断深入的研究,有关GFP及其利用的研究进展较快，现在它已经发展成了现代生物学研究的一个精确工具。目前在细胞生物学、植物学、动物学、微生物学等学科研究中都有着相当广泛的应用。随着人们对GFP发光机制研究的深入,通过对其发光团区域和其它区域进行随机诱变,已经得到了许多GFP突变型,有的发蓝光或黄光而不是绿光[4]；有的发出的荧光比野生型的强很多,激发后很容易用肉眼观察到；有的则是温度突变型,其表达不受温度的限制[5]；有的突变体则可以特异地在某些物种中高效表达。这些突变体极大地拓宽了GFP的应用范围,使GFP在细胞生物学和分子生物学领域的应用显示出更为广阔和诱人的前景。一、GFP的结构

图2绿色荧光蛋白结构GFP编码238个氨基酸的多肽单体，只有完整的GFP分子才会产生生物荧光，被切断的GFP(即使是C、N末端的少数几个氨基酸)亦能导致GFP失去发光能力[6]。与荧光的产生直接有关的是GFP分子中一小段被称为荧光生色团(Chromophore)的部位[7]。在GFP的初级氨基酸序列上，第65～67个氨基酸(Ser-Tyr-Gty)形成环状三肽，以共价形式与GFP蛋白肽键骨架相连。生色团的形成不受种属的限制，其通过细胞内广泛存在的成分的作用或通过自催化作用都能产生。荧光生色团非常稳定,不易变性,用酸、碱处理或者加入盐酸胍都不会使它失去荧光。但是当pH值恢复到中性或者移去变性物时，它的荧光又会恢复到变性前的水平。GFP的生色团之间是通过共价键结合。生色团形成的机理目前尚不清楚，但在有分子氧存在的条件下，酪氨酸氧化成脱氢酪氨酸，并环化形成六肽，这可能是形成色基的必然过程。[8]二、GFP的应用特点1易于检测GFP荧光反应不需外加任何反应底物，酶或其它共反应因子,也就不存在这些物质可能难于进入细胞的问题，只需紫外光或蓝光激发,即可发出绿色荧光，GFP发射的荧光用肉眼或荧光显微镜就可以检测到。灵敏度高,对于单细胞水平的表达也可识别,同时还可利用其进行定量检测。由于GFP对活细胞基本无毒害,因此无须特殊处理就可以很方便地进行活体观察。而且，具有不同光谱特性的GFP突变体的获得,使在同一细胞中同时分析两种不同蛋白或启动子成为可能,可以用于发育细胞学、药物筛选、分析诊断等研究。这就使GFP有可能成为一种快速、简便、经济的标记蛋白，GFP基因作为报道基因可能有广泛的用途。2荧光稳定GFP无光漂白现象，在很大的pH范围内(pH7～12)都可以正常发出荧光，受温度的影响也很小，只有在超过65℃时才会变性，荧光消失。荧光显微镜强光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强[9]。特别在450～490nm蓝光波长下更稳定,但在340～390nm或395～440nm范围内，仍会发生光漂白现象。对于长时间光照，GFP也有很好的耐受性，根据Sheen等的研究，GFP在受体内表达时可以持续得到不低于10分钟的荧光。3广谱性首先表现在它的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达；其次就是没有细胞种类和位置的限制，在各个部位都可以表达，发出荧光。4易于载体构建由于GFP较小，只含有238个氨基酸，编码GFP的基因序列也较短，约2.6kb，所以它可以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。尽管野生型的GFP在某些植物和动物中表达很弱，但可通过更换GFP生色团氨基酸、改变碱基组分、除去内含子、更换强启动子等方法加强表达。Connack等筛选出了三种含Ser65突变的突变体，在大肠杆菌中表达时，荧光强度比野生型高约100倍。5无毒害Chalfie等的研究表明：GFP对生活细胞基本无毒害，Sheen等(1995)的研究进一步表明：在玉米中，即便GFP在细胞中的表达量很高时，对细胞也不会产生明显毒害。但是至今我们还不太了解它对植物再生能力的影响。三、GFP在细胞生物学研究中的应用1对细胞生理过程的监控在过去的几年中，通过随机和人工诱变得到了许多不同颜色的GFP突变体。通过基因操作，许多蛋白都成功的与GFP进行了融合，通过这些融合蛋白就可以对相应蛋白的表达和转运及生理反应进行监控。目前GFP融合蛋白对细胞内迅速的生理反应的报告大概有三种方式：转移和定位、GFP光谱的生化修饰、荧光共振的能量转移(FRET)。Shen[10]等在培养的神经元中发现，细胞内的Ca2+瞬间变化就会引起GFP标记的钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)可逆地易位到突触后膜的densities上。Shi[11]等用GFP标记来监控α-氨基羟甲基恶唑丙酸(AMPA)的受体，发现它会从细胞内膜转移到树突棘的表面，根据突触中AMPA受体的含量可以解释突触沉默、活化的原因和机制。Siegel[12〕等将野生型的GFP插人ShakeK十通道的特殊部位，形成一个异源嵌合体，这个嵌合体发出的荧光将会随着细胞的去极化作用而缓慢的减少。相反，Yanagawa[13]等将β-内酰胺酶插人GFP得到了一个融合体，当此融合体与β-内酰胺酶抑制肽(BLIP)结合时,它的荧光发射量会大大增加。2细胞筛选基于GFP能够吸收、发射光，并且荧光稳定以及检测方法快速、方便的特性，GFP在细胞筛选上应用广泛。譬如应用流式细胞计数仪来筛选蛋白产量增强的细胞。Yuk等[14]使用GFP作为标记能快速筛选出在生长抑制环境下，仍能保持重组蛋白大量表达的CHO细胞。另外，研究发现通过GFP荧光的减少，可以测量出鼠和人细胞的凋亡[15]。利用GFP融合蛋白作为细胞表面活体荧光标记，通过筛选已经获得GFP表达的E.coli、人体肾细胞和猿猴COS-1细胞等特殊类型。SheenJ等在GFP转染玉米原生质体中出现两类细胞丛，第一类与对照相似，呈现红色荧光，约占细胞总数66.3%；第二类细胞丛呈现绿色荧光，荧光强度是对照的74倍[16]。因此，用流式细胞计数仪或荧光活化细胞计数仪(FACS)很容易将两类细胞分离开来。3细胞亚结构及蛋白质分子的定位对于许多蛋白质来说，易位是它们激活机制中的一部分。以前多是用细胞分级分离和免疫细胞化学的技术进行研究，而现在利用GFP融合蛋白的显像技术无疑是一种简便而可靠的检测方法，我们不仅可以更快地而且可以更全面地对蛋白质的移动进行研究。近几年,在GFP技术的进步中最重要的就是对几个GFP突变体的鉴定。通过标准的荧光显微镜，根据它们所发出的不同颜色的荧光，就可以在活细胞中同时而准确的区分多种不同的荧光融合蛋白以及了解它们的分布情况[17]。在实际中，常用蓝绿色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)两种突变体的组合来在活细胞中进行双色显示。而其他的突变体如蓝色荧光蛋白(BFP)和红色荧光蛋白(RFP)的使用还受到许多限制，因为它们有很快的光漂白作用或者是发射的荧光强度太低。最近又发现GFP是一个良好的细胞间信号传递的动态标记分子,可以跟踪观测第二信使,如Ca2+和cAMP水平的起伏变化,细胞间隙pH值的变化等[18]。4用于细胞内蛋白质的动力学研究研究细胞内蛋白质相互作用的技术主要有两种：光漂白荧光恢复法(FRAP)、光漂白荧光损失法(FLIP)。FRAP主要是通过对细胞内特定的点或区域进行强烈的光照，使荧光发生光漂白作用，再通过相同时间间隔的光影像采样记录下荧光恢复的动力学过程。FRAP不仅可以确定细胞器上的蛋白，还可以确定流动蛋白的滞留时间。转录、m-RNA前体的剪切、DNA的修复中蛋白质复合体操作机制都可以用这种方法来研究。FLIP是对细胞的一个区域进行持续性的光漂白，再对光漂白区外的荧光的损失进行监控就可以获得一些标记蛋白之间的相关性信息。目前正在体外通过改变光照点的大小和固定细胞来研究光漂白作用的可逆性，不过还是与活细胞的环境有一定的差距。另外一种可以用来研究细胞内反应动力学的方法就是荧光相关性分光光镜检查(FCS)。这种方法是首先通过聚焦照射在细胞内形成一个一定大小的光洞，光洞中荧光探针的移动会引起荧光的波动，通过校正计算出荧光颗粒的平均滞留时间和平均数量，再根据已知光洞的大小和平均光滞留时间就可以计算出扩散蛋白的动力学参数[19]。5计算细胞生长速度在高水平组合型表达GFP的细胞品系中,在细胞生长的