分子诊断克隆2013

分子克隆

目录Molecularcloning

分子克隆相关概念

来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。克隆(clone)克隆化(cloning)

技术水平分子克隆DNA克隆

细胞克隆组织、器官克隆个体克隆按照人的意愿，在体外将制备的DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝，此过程称为分子克隆，也称基因克隆或DNA克隆或重组DNA(binantDNA)。分子克隆(geneticengineering)上游技术下游技术上游技术:分子克隆目的：分离获得某一感兴趣的基因或DNA

下游技术:基因表达目的：获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程Toolenzyme第一节工具酶工具酶（ToolEnzyme）

限制性核酸内切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆转录酶

T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶

TaqDNA聚合酶一、限制性核酸内切酶RE是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸内切水解酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠrestrictionendonuclease,RE限制外源DNA，保护自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型分类特点属名种名株系EscherichiacoliRY13EcoRⅠ

酶的来源酶的名称命名Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

GGATCCCCTAGG识别序列长度4～8

个碱基对

BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口切口：平端切口、粘端切口5′3′5′3′5′来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶(isoschizomer)。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功异源酶识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，这样的酶称为同尾酶(isocaudarner)。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGBamHⅠGGATCCCCTAGGDNA连接酶(DNAligase)大肠杆菌DNA连接酶T4DNA

连接酶DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端35000（小）76000（大）5´→3´外切酶5´→3´聚合酶3´

→5´外切酶5´→3´聚合酶3´

→5´外切酶枯草杆菌蛋白酶DNA聚合酶ⅠKlenow片段Klenow片段cDNA第二链合成双链DNA3末端标记填补3´末端逆转录酶（reversetranscriptase）是多功能酶，具有三种酶的活性作用：合成cDNA逆转录酶的活性末端脱氧核糖核苷酰转移酶

催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3´末端的-OH上。1.在载体或目的基因3´末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端。2.用于DNA3´末端的同位素探针标记。terminaldeoxynucleotidyltransferase(TdT)作用末端转移酶的催化作用碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）作用：催化核酸的5´末端脱去磷酸基团。碱性磷酸酶的活性T4多核苷酸激酶功能：催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA的5`-OH末端（图）。T4polynucleotidekinaseT4多核苷酸激酶的活性（前向反应）DNA/RNA（单链或双链）T4多核苷酸激酶的交换反应

用途：（1）标记DNA的5`-末端；（2）使缺失5`-P末端的DNA发生磷酸化作用。核酸酶S1

核酸酶S1可水解双链DNA，RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分，其作用是除去双链DNA的黏性末端以产生平末端，除去cDNA合成时形成的发夹结构。S1核酸酶的活性酶主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切割DNA分子DNA连接酶连接两个DNA分子或片段大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ或Klenow酶1制作DNA探针；2合成cDNA第二链；3填补双链DNA3`凹端；4DNA测序。TaqDNA聚合酶聚合酶链式反应（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端标记探针末端转移酶使3`-末端加同聚物尾S1核酸酶降解单链DNA或RNA逆转录酶补平反应，合成cDNA或制探针磷酸酶切除核酸末端磷酸基SUMMARY第二节载体

Vector能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具，其化学本质为DNA分子。质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA载体常用载体载体的分类克隆载体（cloningvector）表达载体（expressionvector）载体应具备的条件：1.能自我复制；2.有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入。多克隆位点（MultipleCloningSites,MCS）:载体上多个限制酶的单一切点(即在载体的其他部位没有这些酶的相同切点)。多个限制酶的单一切点。载体应具备的条件：3.有适宜的分子量，具有较高的拷贝数。4.具有合适的筛选标记。5.与宿主细胞相适应的表达调控元件。

克隆载体（cloningvector）能将外源基因在受体细胞中复制扩增并产生足够量目的基因的载体称为克隆载体。（一）质粒载体质粒

(plasmid)

质粒载体的类型pBR322质粒载体组成特点1.含有一个复制起始点（Ori）。

2.含有四环素抗性(Tetr)基因和氨苄青霉素抗性(Ampr)基因。3.

含有多个限制性内切酶的单一酶切位点，用于插入外源DNA片段。4.外源基因插入抗性基因，导致标志基因失活。目录pUC系列质粒载体组成特点1.分子量小、高拷贝数;2.来自pBR322质粒的Ori和氨苄青霉素抗性基因(Ampr);

pUC系列质粒载体组成特点3.加入了E.colilac操纵子的部分结构：启动子（P）、操纵序列（O）、lacZ′基因。乳糖操纵子(lacoperon)的结构

调控区CAP结合位点启动序列操纵序列

结构基因Z：β-半乳糖苷酶Y：透酶A：乙酰基转移酶ZYAOPDNApUC系列质粒载体组成特点5.来自Wild-M13phage的MCS。4.有lacI（调节基因I）。mRNA阻遏蛋白IDNAZYAOPpol调节基因IPTGlacIlacI（二）噬菌体载体λ-噬菌体M13噬菌体1.λ-噬菌体(phage)

5′5′3′3′cos位点（EMBL4）插入型载体（λgt噬菌体10和λgt噬菌体11）置换型载体M13噬菌体DNA改造的M13mp载体系列（含lacZ基因）2.M13

噬菌体(phage)

+感染型+-复制型（三）黏粒载体粘性质粒(cosmid)是λ噬菌体和质粒的杂种，其优点是可以用来插入较大的DNA片段。Ori（四）酵母细胞中克隆基因常用载体酵母人工染色体yeastartificialchromosome,YAC来源：【酵母染色体DNA+pBR322质粒】类型酵母整合型质粒（yeastintegratedplasmid,YIP）酵母复制型质粒（yeastreplicatingplasmid,YRP）类型酵母附加型质粒（yeastepisomeplasmid,YEP）酵母着丝粒质粒（yeastcentromereplasmid,YCP）YRP+着丝粒区YIP和YCP载体能稳定遗传，但是为单拷贝转化率低，多用于遗传分析。YRP和YEP载体稳定性差，但是对酵母具有较高的转化活性，拷贝数高，YEP被用于基因克隆中的常用载体。

注4.含有适合的限制酶切位点，以便插入外源基因。YAC载体的特点:1.可插入约1000kb的外源DNA。2.能在大肠杆菌中复制，具有较高拷贝数。3.含有在酵母细胞中便于选择的遗传标记。(五)动物细胞基因克隆的载体类型:猿猴空泡病毒40(SV40)载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体。二、表达载体（expressionvector）表达载体能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。（一）原核细胞表达载体原核细胞的表达载体主要是大肠杆菌表达载体。

expressionvectorofprokaryotes大肠杆菌表达载体在克隆载体的基础上，还应具备表达系统调控元件启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号启动子promoterσ因子大肠杆菌中常用的启动子乳糖启动子Lac色氨酸启动子Trp大肠杆菌中常用的启动子人工构建的Tac(trp-lac)启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，可被IPTG诱导。λ噬菌体PL

、PR启动子核糖体结合位点Ribosomebindingsite,RBSSDShine-DalgarnosequencemRNAAGGAAUGUAA终止子Terminator转录终止序列多由一段富含A/T区域和富含G/C的回文结构组成。5`．．．

GGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`

RNA5

．．．GGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT...3

DNA

UUUU...…

茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构5´pppG53

35RNA-polpKK223-3质粒载体的物理图谱外源基因在原核细胞中的表达载体可以分成三种类型3.融合蛋白表达载体1.非融合型表达载体2.分泌型表达载体目录

（二）哺乳动物细胞表达载体如果在原核宿主细胞内表达真核生物的基因，目的基因必须是cDNA。注真核生物的表达载体主要有酵母昆虫哺乳动物细胞

哺乳动物细胞表达载体的DNA序列原核DNA序列能在大肠杆菌中自我复制的复制子和抗药基因的筛选标记。哺乳动物细胞表达载体的DNA序列启动子

增强子转录起始点TATA盒CAAT盒GC盒

增强子AATAAA切离加尾转录终止点修饰点外显子翻译起始点内含子OCT-1OCT-1：ATTTGCAT八聚体5------AAUAAA-5

------AAUAAA--核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAAGTGTGTG转录终止的修饰点5

5

3

33加尾AAAAAAA······3mRNA终止子和加PolyA信号二、穿梭载体（shuttlevector）

人工构建的既带有原核细胞的复制元件、又带有真核细胞的复制元件，既能在原核细胞中复制、又能在真核细胞中复制，在原核和真核细胞分子克隆中均能应用的载体，称为穿梭载体（shuttlevector）。定义穿梭黏粒载体酵母穿梭质粒载体第三节分子克隆的基本步骤BasicProcedure分子克隆的基本步骤目的基因的获取DNA导入受体菌目的基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因

以质粒为载体的DNA

克隆过程目录（一）目的基因的获取（isolation）1.化学合成法2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)5.反转录合成cDNA6.

（一）目的基因的获取（isolation）1.从基因文库中获取基因组文库(genomiclibrary，G-文库)cDNA文库(cDNAlibrary，C-文库)组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的一个物种的所有基因组DNA片段的集合。*从基因组DNA文库获取目的基因目录限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库目录mRNA

cDNA

双链cDNA

重组DNA分子cDNA文库

反转录酶

载体

受体菌

复制*从cDNA文库获取目的基因

逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT目录2.逆转录合成cDNA3.

化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列4.直接从染色体DNA中分离二、克隆载体的选择和构建Digestion三、目的基因与载体的连接LigationBamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接目录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。目录2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体目录4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目录受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)

导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)四、重组DNA导入受体菌（transfer）