花蓟马雄虫对雄虫气味源的嗅觉反应

花蓟马雄虫对雄虫气味源的嗅觉反应

花生鱼刺（trybom），也被称为台湾花鱼，属于营马科，属于环马科。花鱼属于蔷薇科和蓟马科，分布在中国和世界大部分地区（韩云台洞，1997）。它是森林植物的一个重要害虫之一。花蓟马对寄主植物的危害主要表现在2个方面:一是直接锉食植物的茎、叶、花、果实等器官,导致叶片变小、干枯;二是传播多种番茄斑萎病毒属Tospovirus病毒,诱发植物病毒病,造成严重的经济损失(Lewis,1997;NagataandPeters,2001)。目前,对花蓟马的防治方法主要以化学防治为主(吴青君等,2005;钟锋等,2009),但由于花蓟马发育历期较短,个体小且易隐蔽于寄主植物花中,对大多数杀虫剂易产生抗性,从而导致防治的效果并不理想。昆虫信息素作为一种非化学控制措施,不仅可以用于害虫种群动态的监测,同时也可同其他防控措施结合以提高害虫防治效果。聚集信息素是昆虫信息素的一种,已有研究表明,利用聚集信息素是防治蓟马的有效措施之一(KirkandHamilton,2004;Hamiltonetal.,2005)。目前有关蓟马聚集信息素成分鉴定及生物活性的相关研究国内外仍然较少。迄今为止,只有西花蓟马F.occidentalis的聚集信息素得到有效分离和鉴定,包含有(R)-lavandulylacetate和neryl(S)-2-methylbutanoate2种组分(Hamiltonetal.,2005),并且已经开发出相应的生防产品。西花蓟马雄虫产生的性信息素不仅有引诱异性以完成交配的功能,也有聚集两性成虫的功效,因此西花蓟马雄虫产生的性信息素也称为聚集信息素(Hamiltonetal.,2005)。而目前对于其他蓟马释放的聚集信息素成分的提取鉴定目前国内外未见报道。花蓟马和西花蓟马同属于花蓟马属,二者形态及生物学特性均非常相似,那么花蓟马是否同西花蓟马一样也可以释放聚集信息素?其活性成分同西花蓟马所释放的活性成分是否相同?对于这些问题的回答,不仅有助于更深地理解这两种蓟马之间的关系,同时也为开发花蓟马引诱剂提供理论依据。本研究采用Y型嗅觉仪分别测定花蓟马雌雄成虫和西花蓟马雌雄成虫对其自身气味源的嗅觉反应,通过固相微萃取(solid-phasemicroextraction,SPME)方法提取花蓟马雄虫挥发物,然后利用含有不同手性柱的气-质联用仪(gaschromatography-massspectrometry,GC-MS)对挥发物进行组分分离和鉴定。1材料和方法1.1试验设计和饲养花蓟马于2010年采自杭州,西花蓟马于2007年采自北京,两种蓟马分别以四季豆PhaseolusvulgarisL.饲养于人工气候箱(温度26±1℃、相对湿度75%±5%、光照周期14L∶10D)内,试验前花蓟马、西花蓟马已分别在室内连续饲养10代、60代。试验用虫为羽化后2-5d的成虫。1.2机器和工作条件1.2.1仪器1.2.2irasil-dexbc-质谱条件气相色谱工作条件:手性色谱柱BGB-176SE(30m×0.25mm×0.25μm)和手性色谱柱CP-chirasil-DexCB(25m×0.25mm×0.25μm);不分流进样;程序升温:40℃,保持3min,以8℃/min升到200℃,保持5min。进样口温度200℃;载气He(>99.999%)。质谱工作条件:离子源:EI;离子源温度:230℃;四级杆温度:150℃;电子能量:70eV;扫描质量范围35~320amu。1.2.3测试臂之间的夹角依Koschier等(2000)方法设计,并略加改进,Y型嗅觉仪由玻璃制成,适应臂长和测试臂长均为60mm,内径均为5mm,两个测试臂之间的夹角为90°。此装置以气泵为动力,空气流经活性炭、分子筛过滤后形成两个分支,每个分支流经一个空气流量计(LZB-3,余姚市奇泉流量仪表有限公司)、50mL的圆底烧瓶,与Y型管的测试臂相连,各部件之间用teflon管相连。试验温度:25±1℃。1.3行为选择测试1.3.1确定中使用检察器的制作条件及内容利用Y型嗅觉仪测定花蓟马雄虫释放的挥发性物质的生物活性。在进行行为测试之前,利用高纯二氧化碳气体将花蓟马种群瞬间麻醉,然后用软毛笔轻轻将雄虫或雌虫挑出,约50~60头,将其转移至50mL圆底烧瓶中,同时瓶中放一湿润的滤纸片,作为聚集信息素气味源。另一相同的圆底烧瓶,瓶中仅放一相同大小的湿润的滤纸片,不放任何蓟马,作为空气对照源。两个圆底烧瓶的进气口和出气口塞上少量的棉花,防止花蓟马成虫从瓶中跑出,用冷光源(10000lx)对味源瓶进行光照刺激(TerryandGardner,1990)。调节测试臂的流量为60mL/min,适应臂的流量为120mL/min。然后取20头花蓟马雄虫或花蓟马雌虫,进行嗅觉仪试验,测试雄虫或雌虫释放的聚集信息素对不同虫态的吸引作用。当测试蓟马爬过某测试臂的20mm,并持续30s以上,记录其对该气味源作出了选择。蓟马进入Y型管3min内没有作出选择的记为无反应。每测试4头蓟马将Y型管和味源瓶翻转180°。每测完20头蓟马用95%酒精清洗Y型管和味源瓶,120℃烘干。每组处理重复3次,记录反应虫数。1.4光照刺激试验取30~40头花蓟马雄虫将其转移(方法同1.3.1)至1.5mL玻璃瓶中,在距离玻璃瓶2cm的地方用冷光源(大约10000lx)进行光照刺激,引起花蓟马的徘徊和打斗行为。然后利用SPME(100μm,PolydimethylsiloxaneCoating),提取雄虫释放的挥发性物质5h(温度27±1℃、相对湿度60%)(KirkandHamilton,2004)。SPME使用前在GC-MS进样口200℃下活化1h。每组处理重复5次。1.5外消旋体的拆分英国基尔大学(KeeleUniversity)Hamilton等(2005)已经鉴定出西花蓟马雄虫聚集信息素挥发物的2种组分分别为(R)-lavandulylacetate和neryl(S)-2-methylbutanoate,本研究所需标准品(R)-lavandulylacetate(50ng/μL)和neryl(S)-2-methylbutanoate(100ng/μL)均从英国基尔大学获得。据Hamilton等(2005)研究发现,Beta-Dex325手性色谱柱能够有效拆分lavandulylacetate外消旋体,CP-chirasil-DexCE手性色谱柱能够有效拆分neryl2-methylbutanoate外消旋体。本研究采用与上述2种手性色谱柱固定相相同的2种手性色谱柱BGB-176SE(30m×0.25mm×0.25μm)及CP-chirasil-DexCB(25m×0.25mm×0.25μm)进行花蓟马雄虫释放聚集信息素成分鉴定。1.5.1花蓟马雄虫诱导物组r-5-4-methylbachi酒采用手性色谱柱BGB-176SE进行花蓟马雄虫释放挥发性化合物及(R)-lavandulylacetate标准品的鉴定;采用手性色谱柱CP-chirasil-DexCB进行花蓟马雄虫释放挥发性化合物及neryl(S)-2-methylbutanoate标准品的鉴定。采用的手性柱可以有效拆分消旋物,如果花蓟马雄虫释放的挥发性物质中某种组分与标准品的混合物的峰完全重合,就可以确定这种组分是同标准品手性相同的同一物质。将1μL50ng/μL的(R)-lavandulylacetate溶液或1μL100ng/μL的neryl(S)-2-methylbutanoate溶液滴至1.5mL玻璃瓶中,瓶中放一小团脱脂棉。利用SPME吸附(R)-lavandulylacetate溶液或neryl(S)-2-methylbutanoate溶液挥发物1h,然后用GC-MS对其进行分离和鉴定。利用SPME吸附花蓟马雄虫挥发物(方法同1.4)3h,用GC-MS对其组分进行分离和鉴定。首先用SPME吸附花蓟马雄虫挥发物2h,然后利用吸附有花蓟马雄虫挥发物的SPME吸附1μL50ng/μL(R)-lavandulylacetate溶液或1μL100ng/μL的neryl(S)-2-methylbutanoate溶液1h,用GC-MS对其组分进行分离和鉴定。1.5.2gc-ms检测将1μL50ng/μL的(R)-lavandulylacetate溶液和1μL100ng/μL的neryl(S)-2-methylbutanoate溶液分别注射到GC-MS中,测定其峰面积。取30~40头花蓟马雄虫或西花蓟马雄虫将其转移(方法同1.3.1)至1.5mL玻璃瓶中,在距离玻璃瓶2cm的地方用冷光源(大约10000lx)进行光照刺激,利用SPME方法提取花蓟马雄虫或西花蓟马雄虫释放的挥发性物质5h(温度27±1℃、相对湿度60%),每组处理重复5次。据标准品峰面积对花蓟马和西花蓟马雄虫释放的聚集信息素进行定量,从而获得花蓟马和西花蓟马雄虫每头每小时释放的聚集信息素的量。1.6花蓟马聚集信息素的成分分析鉴定数据处理用SPSS13.0软件进行,嗅觉仪测定试验的数据采用二项分布检验的方法进行检验分析。花蓟马聚集信息素的成分分析鉴定,通过NIST08谱图库及2种标准品质谱图进行。花蓟马和西花蓟马雄虫释放量的比较采用独立样本t检验的方法进行的检验分析。2结果与分析2.1行为选择测试2.1.1花蜜马饲料对自身味道的反应反应花蓟马雌虫被花蓟马雄虫气味源所吸引,但不被花蓟马雌虫气味源所吸引;花蓟马雄虫对花蓟马雄虫气味源有极显著的选择性(表1)。2.1.2对克氏原螯虾的选择花蓟马雌虫对花蓟马雄虫气味源的偏好性要显著高于西花蓟马气味源(P<0.001),花蓟马雄虫与花蓟马雌虫选择类似,对花蓟马雄虫气味源有显著的选择性(P=0.002)。西花蓟马雌虫对西花蓟马雄虫气味源的偏好性显著高于花蓟马气味源(P<0.001),同样西花蓟马雄虫对西花蓟马雄性气味源的选择率也显著高于花蓟马气味源(P<0.001)(表2)。2.2花蓟马雄虫释放挥发性组分ab利用手性柱BGB-176SE对(R)-lavandulylacetate标准品、花蓟马雄虫挥发物以及二者混合物进行定性分析(图1)。标样(R)-lavandulylacetate在手性柱中的出峰时间为16.31min(图1:A);花蓟马雄虫释放挥发性组分a在手性柱中的出峰时间同样为16.31min(图1:B);并且二者的混合物在手性柱中的出峰时间仍然一致(图1:C),由此可以确定花蓟马雄虫释放挥发性组分a为(R)-lavandulylacetate。图2(A)是(R)-lavandulylacetate标准品质谱图,图2(B)是花蓟马雄虫释放化合物(R)-lavandulylacetate质谱图。利用手性柱CP-chirasil-DexCB对neryl(S)-2-methylbutanoate标准品、花蓟马雄虫挥发物以及二者混合物进行定性分析(图3)。标样(S)-2-methylbutanoate在手性柱中的出峰时间为20.25min(图3:A);花蓟马雄虫释放挥发性组分b在手性柱中的出峰时间同样为20.25min(图3:B);并且二者的混合物在手性柱中的出峰时间仍然一致(图3:C),由此可以确定花蓟马雄虫挥发性组分b为(S)-2-methylbutanoate。图4(A)是(S)-2-methylbutanoate标准品质谱图,图4(B)是花蓟马雄虫释放化合物(S)-2-methylbutanoate质谱图。2.3r-larend-关于分离的植物政策由图5可以看出2种化合物在花蓟马雄虫和西花蓟马雄虫中的比例是不同的。经GC-MS定量分析发现花蓟马雄虫和西花蓟马雄虫每头每小时释放的(R)-lavandulylacetate的量有显著差异(P=0.001),花蓟马的释放量显著高于西花蓟马;花蓟马雄虫和西花蓟马雄虫每头每小时释放的neryl(S)-2-methylbutanoate的量也有显著差异(P=0.0045)(表3)。3讨论3.1花蓟马雄虫的聚集和释放行为昆虫在寻找配偶的过程中通常会由一种性别的成虫释放出性信息素以引诱异性前来完成交配。研究发现,多种蓟马的雄性成虫腹部具有分泌功能的腺体(Moundetal.,1980),该结构的存在说明雄性蓟马有可能释放聚集信息素(Bode,1978;SudoandTsulsumi,2002)。比如褐翅蓟马Thripsfuscipennis(Haliday)、大蓟马T.major(Uzel)(Kirk,1985)、西花蓟马(TerryandGardner,1990;MattesonandTerry,1992;TerryandDyreson,1996)、番茄蓟马F.schultzei(Milneetal.,2002)雄虫在花上都有聚集行为。已有研究发现,将番茄蓟马的雄性成虫放到灰色粘虫板上能够显著增加对雌性成虫的诱捕量(Milneetal.,2002);西花蓟马雄性成虫释放的气味对于其雄性个体和雌性个体均具有明显的吸引作用(DeKogelandvanDeventer,2003;KirkandHamilton,2004)。在花蓟马成虫对其自身作气味源的行为选择试验中,花蓟马雌虫被花蓟马雄虫气味源所吸引,但不被花蓟马雌虫气味源所吸引,这说明花蓟马的聚集信息素是由雄虫产生。花蓟马雄虫对花蓟马雄虫气味源有极显著的选择性,说明花蓟马雄虫产生的聚集信息素有聚集两性的作用。关于蓟马性信息素的研究,DeKogel和vanDeventer(2003)研究发现西花蓟马雄虫气味源对西花蓟马雌虫有吸引作用,但是对西花蓟马雄虫无吸引作用;Kirk和Hamilton(2004)研究发现西花蓟马雄虫对西花蓟马雌虫和雄虫都有吸引作用;DeKogel和vanDeventer(2003)研究发现随着气味源中西花蓟马雄虫数量的增加,可以增加对西花蓟马雌虫的吸引。我们推测,产生不同试验结果的原因有两个方面,一是在本研究及Kirk和Hamilton(2004)的研究中,花蓟马雄虫和西花蓟马雄虫气味源用冷光源进行光照刺激,引起蓟马的徘徊和打斗行为,蓟马的这种行为是聚集信息素产生的条件(TerryandGardner,1990;TerryandDyreson,1996);二是试验所用的雄虫数量的不同,蓟马雄虫数量较少时,产生的聚集信息素浓度较低,不易被蓟马成虫发现,而雄虫数量多时,释放的聚集信息素总浓度较高,易于被别的蓟马发现,这个推论还有待进一步证明。3.2对西花蓟马雄虫的诱变效果Hamilton等(2005)在西花蓟马雄性个体中成功分离并鉴定出2种聚集信息素组分,分别为(R)-lavandulylacetate和neryl(S)-2-methylbutanoate,并确定neryl(S)-2-methylbutanoate为有效活性物质。本研究通过2种不同的手性柱对花蓟马雄虫释放的挥发物进行鉴定,结果发现花蓟马雄虫释放的2种聚集信息素分别为(R)-lavandulylacetate和neryl(S)-2-methylbutanoate,其与西花蓟马雄虫释放的2种聚集信息素组分是相同的。本研究将花蓟马雄虫与西花蓟马雄虫释放的2种聚集信息素进行定量分析,结果发现(R)-lavandulylacetate和neryl(S)-2-methylbutanoate在花蓟马和西花蓟马雄虫中释放的比例显著不同。在进一步的行为学试验中,我们发现花蓟马雄虫气味源对花蓟马雌雄虫具有极显著的引诱效果,但对西花蓟马雌雄虫没有吸引作用;西花蓟马雄虫气味源对西花蓟马雌雄虫具有极显著的引诱效果,但对花蓟马雌雄虫没有吸引作用。在种类繁多的昆虫世界中,存在生殖隔离机制,它是由生态行为、形态或生理上的原因引起的,其中包括昆虫的性信息素,性信息素释放时间、化学成份和成份配比的不同,造成了昆虫的生殖隔离(石奇光和赵祖培,1986;TabataandIshikawa,2005;Pélozueloetal.,2007)。性信息素组分的差异是推进物种特异化过程的重要因素(Linnetal.,2007)。Monti等(1995)对Spodoteralatifascia(Walker)以及S.descoinsi(Lalannecassousilvain)2个近缘种群进行比较研究,发现它们雌蛾的性信息素组份是相同的,但各个种群的最佳诱芯配比不同。而性信息素活性物质比例的不同,能够引起不同的行为反应。例如,梨小食心虫Grapholitamolesta能够辨别不同比例的性信息素组分(E)-8-dodecenylacetate和(Z)-8-dodecenylacetate,从而产生不同的行为反应(LinnandRoelofs,1983)。本研究发现花蓟马与西花蓟马雄虫释放的2种聚集信息素组份相同,而定量分析表明花蓟马和西花蓟马雄虫释放的(R)-lavandulylacetate和neryl(S)-2-methylbutanoate2种组分的比例分别为1∶1.7和1∶12.9,聚集信息素组份比例的不同引起了不同的行为反应,使花蓟马雄虫气味源只对花蓟马雌雄虫有吸引作用,西花蓟马雄虫气味源只对西花蓟马雌雄虫有吸引作用,聚集信息素比例的不同可能是导致花蓟马和西花蓟马生殖隔离的原因之一。昆虫同种种群之间的地理隔离有可能引起种群信息素的变异。Hansson等(1990)对欧洲保加利亚和西亚亚美尼亚的小地老虎Agrotissegetum种群雌蛾的性信息素组分进行研究,结果表明3种主要性信息素组分Z5-10:Ac,Z7-12:Ac和Z9-14:Ac的比例分别是1∶42∶57和1∶52∶47,其配比并不相同。Huang等(1998)对日本不同区域抽样调查亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis性信息素的地理变异发现,南部种群与北部种群有相