微生物分离培养

MixedcultureSeparationofsingleculturesPureculture研究思路CellCycleInhibitionApoptosisNecrosisP388.K562CellsbioactivemicrobeDereplication第1页/共17页CultivationOptimizationActiveAxtractCC,PTLC,PHPLCSephadexLH20IR,UV,MS,NMRCD,ORD,X-RayBioactivityReassayEvaluationofanticanceractivitiesFromMicrobeHosttoStructure第2页/共17页微生物分离筛选路线样品稀释平板涂布

平板划线纯化斜面保藏预处理选择性培养基第3页/共17页·初筛（5ml液体试管培养）复筛（100ml三角瓶培养）菌株照相（菌落形态、显微形态）代谢产物指纹图谱（TLC、HPLC）保藏（斜面一支，砂土两支，甘油四支，大发酵菌株发酵种子液甘油管两支）菌株登记菌株第4页/共17页菌株编号分离菌株时格式：样品编号+两位序号（如从SY01样品中分离的菌株，编号依次为SY01-01,SY01-02等）活性菌株编号由四部分组成：单位+研究室+分离人姓名首字母+序号组成（如QD-NP-ABC-01）。活性筛选工作结束后，上交活性菌株（斜面、砂土、甘油）、活性菌株浸膏、薄层照片、HPLC指纹图谱、微生物培养形态、显微形态照片，分离的活性菌株详细填写菌株登记表（Access表格）。第5页/共17页倒制平板①将融化的琼脂培养基，冷却至50℃左右。②在酒精灯火焰旁，以右手的无名指、小指夹持棉塞，左手掀开皿盖。右手持三角瓶向皿内注入培养基。③将培养皿稍加以旋转摇动后，置于水平位置待凝。第6页/共17页稀释第7页/共17页①将菌种用无菌水制成悬液。②取若干只无菌试管，每只内盛9ml无菌水。③吸取上述菌悬液lml加入第1只含有无菌水的试管内。这样就使第1只试管细菌浓度为原菌悬液的l/lO，也就是10-1。④从第1只试管内(10-1)吸取lml注入第2只含有无菌水的试管内，这样试管内的细菌浓度为原菌悬液的1/100，也就是10-2。⑤用同样方法，制成10-3～10-8的菌悬液。第8页/共17页涂布第9页/共17页斜面接种第10页/共17页①操作前，先用75％乙醇擦手，待乙醇挥发后才能点燃酒精灯。②将斜面菌种管和欲接种的斜面试管同时拿在左手的大拇指和其它四指之间，长有菌苔的一面向上，并处于水平位置。③先将菌种管和试管的棉塞旋松，便于接种时取出。④右手拿接种环，与通常拿笔一样。将要伸入管内部分的金属柄和金属丝在酒精灯焰上灼烧灭菌。⑤用右手小指、无名指及手掌将菌种管和试管的棉塞同时拔出，并把棉塞握住，不随意放在桌上或与其它物品相接触，再以火焰烧管口。⑥将上述在火焰上灭菌过的接种环伸入菌种管内，接取菌种前先在管内壁上或未长苔的培养基面上接触一下，使接种环充分冷却，以免烫死菌种。用接种环轻轻刮取少许苔后，自菌种管内抽出。抽出时勿与管壁相碰，也勿再通过火焰。迅速将沾有菌种的接环伸入待接种的斜面培养基试管内，由里到外划折线，使菌体粘附于培养基上。划线时，勿用力划破培养基。⑦接种完毕后将接种环抽出，灼烧管口，塞上棉塞。加棉塞时，不要用试管口去迎塞，以免试管在移动时污染杂菌。⑧接种环在放回原位前，要经火焰灼烧灭菌。第11页/共17页①在酒精灯火焰上灼烧接种环，待冷却，取一环菌液。②左手握住琼脂平板，用大拇指和食指稍抬起皿盖，同时靠近火焰周围，右手持接种环伸入皿内，在平板上一个区域作“之”形来回划线。划线时使接种环与平板表面成30º～40º角轻轻接触，以腕力在表面作较快的滑动，勿使平板表面划破或嵌进培养基内。③灼烧接种环，冷却后，再将平皿转动一定的角度，接种环通过划过线的区域，在第二区域继续划线。④划后再灼烧接种环，冷却后用同样的方法在其它区划线。⑤全部划线完毕后，在平皿底注明菌种、姓名和日期等。将培养皿倒置放入恒温箱培养。⑥适当温度培养一段时间后，取出观察。

平板划线第12页/共17页第13页/共17页newmarinegenusSalinisporatropicaMarinisporasp.第14页/共17页第15页/共17页

检查冷凝桶内水位是否高于最高位置或低于最低位置，打开锅盖检查锅内水位是否漫过低盘。待灭菌完毕后，等温度降至60℃以下，压力表显示为零后