细胞融合及应用

第七章

细胞融合与应用第一节细胞融合概述细胞融合（cellfusion)，又称体细胞杂交（somatichybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。一、细胞融合的定义Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。20世纪80年代出现了电融合技术。二、细胞融合研究历史生物种类细胞来源成功年代烟草两个种间苷蓝——青菜大豆——马唐草矮牵牛——龙面花大麦——花生大麦——大豆小麦——矮牵牛油菜——大豆玉米——大豆大豆——野豌豆大麦——蚕豆大豆——草香木犀酵母菌——鸡大豆——烟草大豆——秋水仙人——胡萝卜番茄——马铃薯人——小鼠叶——叶叶——根愈伤组织——叶叶——花瓣种子——种子叶——悬浮细胞叶——花瓣叶——悬浮细胞叶——悬浮细胞悬浮细胞——悬浮细胞叶——根悬浮细胞——叶原生质体——血红细胞悬浮细胞——叶悬浮细胞——叶腹水癌细胞——原生质体叶——根尖纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞197219721972197319741974197419741974197419751976197619761976197619781978几种细胞融合成功的例子植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合的细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞

动物细胞融合实验使用的小白鼠三、动植物细胞的融合过程植物细胞融合过程人造小鼠培育过程示意图四、细胞融合的意义理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。第二节细胞融合的基本原理显微镜下细胞融合过程融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解第三节细胞融合的常用方法物理法：显微操作，电场刺激等化学法：硝酸钠诱导、PEG结合高pH，高钙离子法p167生物法：仙台病毒法一、仙台病毒法仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚；②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；②细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；④融合成巨大细胞，仍需ATP。基本原理：是利用病毒具有凝集细胞的能力病毒法的主要步骤两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图

聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。PEG浓度以W/W；如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合（假定1ml培养液为1g重)，即成50％PEG溶液。PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好，50％PEG溶液能产生最多杂交细胞。PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。优点是易得，用法简单，融合效果稳定。二、聚乙二醇（PEG）法聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程PEG的作用机理：Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。

（1）将两种不同亲本细胞各5×l06混匀；（2）离心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟；（4）加9ml培养液，离心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养液至5ml，37℃的CO2培养箱中培养。（6）6—24小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤PEG诱导的细胞融合过程示意图

三、电融合法

电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。电融合法的优点：融合率高、重复性强、对细胞伤害小；装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。电融合法的基本过程电融合诱导法原理示意图第三节杂种细胞的筛选根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其分为以下几种类型：异核细胞：非同源细胞的融合体。同核细胞：两个相同细胞的融合体。多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。杂种细胞筛选方法：1．遗传互补筛选法2．抗性互补筛选3．生长特性筛选法4．物理特性筛选法5．其它方法基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选具有所需性状杂种细胞的筛选常用的杂种细胞筛选方法第四节细胞融合技术应用举例

动物细胞融合—单克隆抗体生产利用原生质体融合和培养技术培育新植物微生物原生质体融合构成新菌株一、何谓单克隆抗体？应用1：细胞杂交瘤技术与单克隆抗体只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。T淋巴细胞：即胸腺依赖淋巴细胞（thymusdependentlymphocyte）。亦可简称T细胞。来源于骨髓的多能干细胞（胚胎期则来源于卵黄囊和肝）。目前认为，在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。T细胞的再循环有利于广泛接触进入体内的抗原物质，加强免疫应答，较长期保持免疫记忆。T细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原和表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。人类免疫系统的介绍

外分泌淋巴系统：呼吸道和生殖泌尿系统内分泌淋巴系统：胸腺、骨髓、脾脏、扁桃体、淋巴结等B淋巴细胞：来源于骨髓的多能干细胞。在禽类是在法氏囊内发育生成，故又称囊依赖淋巴细胞（bursadependentlymphocyte）/骨髓依赖性淋巴细胞简称B细胞，是由骨髓中的造血干细胞分化发育而来。与T淋巴细胞相比，它的体积略大。这种淋巴细胞受抗原刺激后，会增殖分化出大量浆细胞。浆细胞可合成和分泌抗体并在血液中循环。成熟的B细胞经外周血迁出，进入脾脏、淋巴结，主要分布于脾小结、脾索及淋巴小结、淋巴索及消化道粘膜下的淋巴小结中，受抗原刺激后，分化增殖为浆细胞，合成抗体，发挥体液免疫的功能。B细胞在骨髓和集合淋巴结中的数量较T细胞多，在血液和淋巴结中的数量比T细胞少，在胸导管中则更少，仅少数参加再循环。B细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原及表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。

B1细胞为T细胞非依赖性细胞。B2为T细胞依赖性细胞。B细胞在体内存活的时间较短，仅数天至数周，但其记忆细胞在体内可长期存在。

B细胞淋巴瘤是一种最常见的淋巴细胞白血病，有关这种疾病的研究不断涌现。

单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myelomacell)与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridomacell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridomatechnology）。NielsK.Jerne

G.Kohler

C.Milstein

免疫网络学说单克隆抗体：1984Nobel二、杂交瘤技术的基本原理三、杂交瘤细胞的制备（一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）HAT培养基次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）（二）免疫小鼠

免疫程序是取6—8周龄Balb／C雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强免疫一次，3—5天后用于融合。免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为l00g，第二次为50g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1×l06一1×107。（三）脾细胞的制备(1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；(2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml无血清培养液冲洗一次；(3)把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中；(4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可；(5)把细胞悬液注入50ml离心管中，加l0一20ml培养液：轻轻吹打数次，室温中置5分钟；(6)离心(800一1000转／分)计数、备用。（四）细胞准备（1）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，计数活力细胞(不少于90％)；（2）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，并计细胞数和测定活力细胞；（3）按1：5或1：10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸净多余上清。（五）细胞融合(1)将1ml40％的PEG液一滴滴加入列细胞团中，在60秒内加完，同时并不断轻微转动离心管或用手指轻弹离心管；(2)在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60秒钟内加完；(3)于5分钟内慢慢加完20ml无血清培养液；此时细胞对机械损伤非常敏感，(4)离心(800转／分，8分钟)，去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取等体积细胞悬液，向另一96孔板中加50P1；(7)送入5％CO2，温箱中37℃培养，24小时后更换成HAT选择性培养掖。（六）融合后细胞培养(1)融合后7—10天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加一半新的)后每隔2—3天半量换液一次；(2)两周后可改用HA培养液半量换液，或仍用HAT培养液；(3)2—3周后出现杂交细胞集落，细胞个大、圆且透明；(4)待集落增殖生长至1／3孔时，应进行抗体检测。HAT培养基次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）（七）抗体检测免疫荧光试验放射免疫试验(RIA)联免疫吸附试验(ELISA)（八）单克隆抗体的大量制备体内接种法体外培养法血清法腹水法传统培养法生物反应器培养法四、单克隆抗体的应用单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病诊断，以提高疾病诊断的准确性。利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成本，同时也增加了疫苗的安全性。单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜在技术。单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不断发展。五、人源单克隆抗体为什么制备人源单克隆抗体？p131主要困难（1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力；（2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来说，高度免疫获得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行的；（3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。人源性单克隆抗体的制备方法：p132（1）人-鼠杂交瘤单克隆抗体（2）人-人杂交瘤单克隆抗体（3）严重免疫缺陷小鼠制备人源化单克隆抗体（4）基因工程单克隆抗体应用2：利用原生质体融合和培养技术培育新植物1．植物原生质体培养的意义：①融合产生体细胞杂种②分离或引入各种细胞器③导入外源基因④诱发突变体⑤研究细胞信息传递、能量转换、物质运输等⑥研究细胞壁的合成机制⑦研究膜的功能与细胞膜的相互作用⑧研究核质关系⑨研究疾病与抗性机理2原生质体制备过程原生质体的来源:

*植物叶片 取材容易 比较容易用酶解法分离*植物根尖组织 可由各种植物的种子萌发后取得*植物花粉 产生单倍体原生质体*愈伤组织、悬浮培养的细胞细胞壁容易解离植物原生质体纯化的方法：目的：去除破碎的原生质体、末去壁的细胞、细胞器及其他碎片等杂质。

(1)沉降法

(2)漂浮法

(3)界面法（1）沉降法原理：

利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤（44-169μm的筛网），然后低速离心（900-4500r/min，2min)，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部.优缺点：

比较简单但不易除尽一些完整的细胞，或引起原生质的破碎（2）漂浮法原理：采用比原生质体比重大的高渗溶液，使原生质体漂浮在溶液表面。

优缺点：可以得到较为纯净、完整的原生质体，但完好的原生质体数量较少（3）界面法原理：采用两种比重不同的溶液，使原生质体处于两液相的界面之中。优缺点： 可以收到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。3原生质体培养①液体培养分：液体浅层培养液体悬滴培养②固体平板法③双层培养法4利用原生质体融合培育新植株生物种类细胞来源成功年