姜酚对牛ii型胶原诱导性关节炎大鼠的抗炎作用

姜酚对牛ii型胶原诱导性关节炎大鼠的抗炎作用

风湿性关节炎（ra）是一种常见的自身免疫性疾病，由多关节滑膜慢性炎症引起，滑膜纤维母细胞增生，大量淋巴结、肝细胞和浆细胞浸润。目前，还不清楚疾病的机制。近年来诸多研究表明,部分免疫细胞及其分泌的细胞因子在RA的滑膜炎症反应、血管翳形成和骨质的破坏起了非常重要的作用。本研究通过建立胶原诱导性关节炎(CIA)模型大鼠,观察姜酚对CIA模型大鼠关节炎症及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-1β(IL-1β)的影响。1材料和方法1.1动物6周龄Wistar大鼠40只,雌性,体质量(160±20)g,重庆滕鑫生物技术有限公司,合格证号:SCXK(京)2009-0004。1.2试剂盒和姜酚牛II型胶原(CollagenTypeII,批号:C7806-2)、弗氏完全佐剂(Freund謘scompleteadiuvant,FCA,批号:F5881),美国Sigma公司;TNF-α、IL-1、IL-1βELISA试剂盒,美国ADL公司,批号:RT110371;姜酚,贵州百灵企业集团制药股份有限公司,批号:20120308142128663;雷公藤多苷片,湖南协力药业有限公司,批号:20101101。1.3酶联免疫检测dg5033aLD25-2自动平衡离心机,北京医用离心机厂;DG5033A酶联免疫检测仪,上海同舸工贸有限公司。YLS-7B大鼠足趾容积测量仪,淮北正华生物仪器设备有限公司,校零误差:≤±5μL。1.4iii型胶原原激活剂iii参照文献方法,用电子秤称取牛II型胶原20mg置于试管中,加入0.1mol·L-1醋酸5mL搅拌混匀,再加入弗氏完全佐剂5mL充分混合乳化,制成2mg·mL-1的II型胶原抗原注射液,于每只大鼠尾根部及背部多点注射0.2mL,同时于大鼠膝关节注射0.1mL,第7天和第15天加强免疫2次,每天观察大鼠关节肿胀程度。1.5模型组和给药Wistar大鼠随机分为空白对照组、模型组、姜酚组(0.21mg·kg-1)和雷公藤多苷阳性对照组(7mg·kg-1),每组10只。致炎21d后灌胃给药,空白对照组和模型组给予等容积生理盐水。给药28d后,断头处死大鼠采血,离心取血清用于细胞因子活性测定,取大鼠膝关节滑膜及软骨于10%的中性福尔马林固定,用于病理检测。1.6踝骨号测量足水肿度于致炎前用水容积置换法测量各组大鼠双后肢踝关节毛际以下容积,取平均值,致炎后再次测量双后肢踝关节毛际以下容积,每周1次,计算足肿胀度(肿胀度=致炎后足跖容积-致炎前足跖容积)。1.7膝关节评分采用关节炎指数积分法评定,根据关节红肿程度和范围以及关节肿大变形情况进行评定:0分,无关节受累;1分,一个关节或关节区受累(出现关节红肿);2分,两个关节或两个关节区受累;3分,两个或两个以上关节区受累;4分,整个肢体受累;4只肢体评分相加得到关节炎总分。关节区为趾骨关节、跗骨关节、踝关节。1.8脱钙、he染色取CIA大鼠右膝关节滑膜及部分软骨置于10%的中性福尔马林中固定,8%EDTA溶液脱钙,常规梯度脱水、浸蜡、包埋、切片,HE染色。光镜下观察关节滑膜细胞和血管的增生,滑膜层及滑膜下层淋巴细胞浸润和软骨的增生及破坏等情况。1.9封板时封板的制备采用ELISA法,按照ELISA试剂盒说明书进行操作,先加入标准品和待测样品,设置阴性对照,用封板膜封板后置37℃温育30min,揭去封膜,弃去液体,甩干,加洗涤液重复洗板5次。加入酶标试剂,再次置37℃温育30min,洗板5次,加显色液A、B各50μL,37℃避光显色15min,加入终止液终止反应,于450nm波长酶标仪检测吸光度(OD值)。1.10方差齐时,方差齐时,tamhencesc2检验采用SPSS15.0统计软件,多组间比较用单因素方差分析,方差齐时,各组间两两比较采用LSD检验,方差不齐时,则采用Tamhance謘sT2检验,P<0.05表示差异有显著性意义,P<0.01表示差异有非常显著性意义。2结果2.1异有显著性意义模型组大鼠踝关节肿胀明显,双后肢踝关节肿胀,与空白对照组比较差异有显著性意义(P<0.05,P<0.01)。给药1~4周,姜酚组和雷公藤多苷组大鼠踝关节肿胀均有明显减轻(P<0.05,P<0.01),两给药组间比较无统计学意义(P>0.05),见表1。2.2膝关节指数积分大鼠致炎后20d至给药后14d,各组关节炎指数积分无显著性意义,且随着免疫时间延长,关节炎指数积分增加。给药第3周(21d)后,姜酚组和雷公藤多苷组关节积分明显低于模型组(P<0.01),两给药组间比较差异无显著性意义(P>0.05),见表2。2.3术中新生血管及滑膜的变化空白对照组大鼠膝关节滑膜未见明显的血管扩张、增生及炎细胞浸润。模型组滑膜组织可见明显的血管增生、增厚、炎细胞浸润、水肿,软骨组织增生。姜酚组滑膜组织可见少量新生血管及滑膜轻度增生,未见炎细胞浸润、水肿,软骨组织可见轻度增生及关节面骨质损伤,未见骨小梁结构改变。雷公藤多苷组可见较多滑膜血管新生和部分炎性细胞浸润、水肿,见图1。2.4组明显降低p>0.1与空白对照组比较,模型组TNF-α、IL-1、IL-1β明显升高(P<0.01)。与模型组比较,姜酚组、雷公藤多苷组TNF-α、IL-1、IL-1β水平明显下降(P<0.01);两给药组间比较差异无显著性意义(P>0.05)。3ra系统作用机制RA是以对称性多关节炎为主要临床表现的慢性、进行性、侵袭性疾病,进行性的关节结构破坏为其病理学的主要特点,其主要原因是血管翳的形成及骨的侵蚀,主要的病理变化为关节滑膜的慢性炎症,初期滑膜充血、水肿、增厚,血管翳形成,软骨和软骨下骨破坏。在其发病过程中主要发生T细胞免疫反应、滑膜细胞免疫反应、细胞因子的自分泌及旁分泌作用、B细胞产生自身抗体等。RA病变关节局部免疫细胞、炎性细胞、细胞因子、炎症介质等大量聚集,尤其是Th细胞及其所分泌的细胞因子在RA发病和整个病程中起着非常重要的作用。过量的Th1细胞因子可引起局部慢性炎症和基质破坏,其中TNF-α、IL-1是2种主要的促炎细胞因子,它们在类风湿血管翳的形成中共同起到“中心罪犯”的作用。在RA时IL-1和TNF-α均可以刺激滑膜成纤维细胞和软骨细胞产生包括基质金属蛋白酶(MMP)在内的炎性介质,从而降解关节软骨、蛋白多糖、胶原。IL-1和TNF-α协同作用刺激内皮细胞表达黏附分子,增加白细胞由血流向关节的移动。此外,在IL-1和TNF-α的共同作用下,滑膜巨噬细胞可以进一步分化为破骨细胞,导致边缘骨质的破坏。而IL-1β在RA早期能增加内皮细胞间黏附分子的表达,诱导中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的趋化,诱导IL-6参与免疫调节过程,刺激成纤维细胞的增生。RA关节腔损伤机理中,IL-1β的局部生物效应发挥充分,IL-1β进一步诱导成纤维细胞和软骨的前列腺素E2、胶原酶的产生,增强破骨细胞活性,促进关节软骨和骨破坏。姜酚是生姜中提取的主要辣味物质,包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、12-姜酚等10余种成分,这些成分分子结构类似,都有β-羟基酮结构。姜酚以6-姜酚含量最高,其生物活性也最强。6-姜酚通过抑制花生四烯酸代谢过程中环氧酶及脂氧酶,减少炎性介质前列腺素和白三烯的生物合成,拮抗佐剂性关节炎大鼠产生原发性和继发性炎症反应。我们根据其抗炎作用机制,将姜酚用于治疗类风湿关节炎,研究结果显示姜酚对RA有较好临床疗效,能够明显改善RA患者关节疼痛、关节压痛指数、关节功能、关节肿胀及僵晨时间,并能够降低血沉、C反应蛋白。本研究结果显示,模型组大鼠踝关节肿胀明显,滑膜关节组织可见血管增生、增厚,炎细胞浸润、水肿,软骨组织增生,关节炎指数积分逐渐增加,于免疫后41d左右达到高峰,说明造模成功。姜酚组大鼠踝关节肿胀明显减轻,关节滑膜组织可见轻度新生血管及滑膜增生,无明显炎细胞浸润、水肿,关节炎指数积分明显下降,说明姜酚能够抑制CIA大鼠关节