利用环氧树脂制备控制技术制备乌梅蛋白肽的反应动力学研究

利用环氧树脂制备控制技术制备乌梅蛋白肽的反应动力学研究

乌鲁明是以乌江为基础的。通过单酶或多酶反应合成后，产生了一种生物活性茶多酚，具有抗逆、抗衰老、提高身体肌力等功能。目前,乌鸡蛋白酶促水解的研究主要集中在产品和工艺开发上,在动力学方面的研究相对较为滞后,究其原因,主要是因为酶促水解反应过程中肽链断裂数目、位点与顺序难以准确预测,产物的组成又极为多样,即不同长度的肽链在酶解产物中均有分布,并且由于不同长度的肽链对反应抑制的程度不同,以及酶促水解过程中酶热失活、底物与产物抑制等因素的影响,使得酶促水解过程动力学极为复杂.近年来,国内外已开展了相关的蛋白质酶解的动力学研究,有的研究单底物酶促水解本征动力学模型,或用半经验的数学关联式来描述水解度与时间的关系以表征水解宏观反应.本研究以乌鸡蛋白为底物,探讨了木瓜蛋白酶限制性酶解过程中的热失活、底物抑制以及酶促动力学模型,旨在为实际操作提供理论依据.1材料和方法1.1仪器、试剂和仪器乌鸡:市售,个体重1.0kg左右;乌鸡肉糜:水分73.45%,蛋白质20.01%,脂肪4.65%;木瓜蛋白酶:酶活4×105mol/(s·kg),广州裕立宝生物科技有限公司;NaOH、HCl、浓硫酸、甲醛、H2SO4,均为化学纯.HimacCR22G型高速冷冻离心机,日本HITACHI公司;Alpha-4真空冷冻干燥装置,德国Christ公司;Waters高效液相色谱仪,美国Waters公司;BÜCHI全自动凯氏定氮仪,瑞士BÜCHI公司;JB-2型恒温磁力搅拌器,上海雷磁仪器厂;HHS-2D电热恒温水浴锅,上海医疗器械厂.1.2实验方法1.2.1微生物指标测定乌鸡−→→绞碎成肉糜−→→加水打浆−→70℃→70℃预热10min−→10min→加木瓜蛋白酶酶解−→→沸水中保温20min灭酶−→→水解度测定−→4000r/min→4000r/min离心15min−→15min→硅藻土过滤−→→清液−→→指标测定−→→冷冻干燥1.2.2氨态氮含量的测定取一定量(质量为m,体积为V)底物蛋白质量浓度为ρ的水解物移至100mL小烧杯中,加入60mL去CO2蒸馏水,在电磁搅拌下用pH计指示其变化,先用NaOH溶液预先调pH值至8.2,然后加入20mL中性甲醛溶液,搅拌10min后,再用标准浓度为c0的NaOH溶液滴定至pH值为9.2,并记下消耗的NaOH溶液的体积(V2),作空白试验,测得消耗NaOH溶液的体积(V1),则氨态氮含量cN和水解度D为:cN=c0(V2-V1)/V;D=c0(V2-V1)/(8.09ρm)×100%.1.2.3不同保温时间对果汁中微生物酶活性的影响称取50mg木瓜蛋白酶,溶于0.1mol/L的pH值为6.0的磷酸缓冲液并定容至100mL,在一定温度下的水浴中保温不同时间,取一定量的酶液,根据改良的Weetall和Mason方法分别测定木瓜蛋白酶的酶活,计算出不同保温时间下的酶活,绘制出失活曲线,求出酶失活速率.2结果与讨论2.1温度对残余酶活的影响在酶质量浓度为0.01mg/mL时,其酶活为4×103mol/(s·mL)的情况下测定不同温度50,60,70,80和90℃下木瓜蛋白酶的热失活曲线,结果见图1.由图1可见,随温度的升高,失活速率逐渐加快.90℃下保温80min后,残余酶活仅为7%.另外,不同温度下酶的失活符合酶热失活一级动力学方程a=e-kdt.在一定温度范围内,不同温度下的酶热失活常数又服从阿伦尼乌斯(Arrhenius)方程:k=k0e(-Ea/RT),因此,可计算出各温度下酶失活过程的热失活常数Kd、半衰期t1/2及过程的热力学函数ΔH*,ΔG*和ΔS*,见表1.从表1可知,温度在50℃时,失活速率常数Kd较小,且残余酶活与时间的关系近似呈直线;但温度在90℃时,失活速率常数Kd相对较大,且当时间增加幅度不大时,对残余酶活也有较大的影响,因而失活曲线呈现出双曲线形.由此可计算得出热失活过程的活化能Ea为49.94kJ/mol,这说明木瓜蛋白酶较易失活,易受温度影响.2.2l-b作诱导物对鸡的诱导酶解选取底物质量浓度为30,50,60和70g/L,加酶量为4mol/(s·g),进行酶解试验.为了保证反应速度尽可能接近反应初速度以及尽量降低生成产物对酶的抑制作用,本研究利用10min内的氨态氮含量生成的平均速度(v)来代替反应初速度,结果如表2所示.利用L-B作图法,可求得米氏常数Km=5.70×10-3mol/L,这与已知的大多数纯酶的Km数量级10-2～10-5是相符的,说明木瓜蛋白酶对乌鸡蛋白的亲和能力较强.但在反应动力学的研究上,简单的米氏常数还难以真实地描述此反应过程.而且由于蛋白质水解物的功能、生理特性与其水解度有密切关系,在蛋白的水解过程中,水解度的准确控制非常重要,因此有必要用水解度来建立酶解速率的动力学模型,然后根据实验来推断此模型中的动力学常数和底物及产物抑制动力学常数.2.3不同底物质量酶解过程动力学参数的确定根据文献可推导出酶解动力学模型的公式为:D=1n(1+ab)/b,其中,a=KcatρE0/ρ0,b=K2Km/Kcat反应速度的动力学模型为v=aρ0e-bD,式中D为水解度,a与b为动力学参数,Kcat为酶的催化常数,ρ0为初始底物浓度,ρE0为初始酶浓度,Km为米氏常数,K2为酶抑制常数.不同体系的a,b可通过实验得到,本文即在初始酶质量浓度分别为0.15,0.30,0.60,1.20和2.40g/L(酶活为4×105mol/(s·kg)),底物质量浓度为60g/L,温度为70℃下进行试验,结果见图2.从图2中取出相关的水解度与水解时间的数据,应用推导出来的公式进行综合运算,得到不同ρE0/ρ0所对应的动力学参数a与b的大小,见表3.从表3可知,a随着ρE0/ρ0的增加而成直线上升,b为一个常数,通过试验求出来的b值接近一个常数,在其平均值0.097附近上下波动,因此b就取其平均值0.097.再以ρE0/ρ0作为横坐标,a值为纵坐标作图,结果见图3.从而可知a值与ρE0/ρ0的线性关系曲线为:a=17.461ρE0/ρ0+0.1248,其与纵坐标轴的截距不为0,这主要是因为在酶解过程中,可能是有少量内源酶起到了一定的水解作用,或是由于酶解过程中的物理搅拌暴露出一些结合蛋白质的N端,从而使游离氨基氮有一定程度增加.从图3可求得酶解水解度的动力学模型为:D=10.3091n[1+(1.694ρE0/ρ0+0.012)t],反应速度动力学模型为:v=(17.461ρE0+0.1248ρ0)e-0.097D.从模型可知,水解度随底物含量的增加而减少,随酶用量的增加和时间的延长而增加,反应速度随水解时间的延长反而降低.2.4蛋白酶失活的动力学检验由于ab=(KcatρE0/ρ0+C1)K3Km/Kcat=KiρE0/ρ0+C2,其中K3和Ki为酶抑制常数,C1和C2是常数.故从表3获取a,b以及ρE0/ρ0值,做ab对ρE0/ρ0的图,结果见图4.从而可求得酶解过程中蛋白酶失活的动力学常数为:Ki=K3Km=1.5898min-1.木瓜蛋白酶可控酶解乌鸡蛋白时的Ki值较小,说明底物及产物抑制作用较强,若能采用适宜的分离技术将产物分离出去,则可使化学平衡右移,减小甚至消除产物抑制,提高转化效率.2.5不同底物浓度的动力学模型结果比较根据可控酶解动力学模型的计算结果,与实际试验结果进行对比,可以验证理论的动力学模型对实际试验的吻合程度,说明其实际的应用意义.故在初始酶含量为1.20g/L(酶活为4×105mol/(s·kg))、温度为70℃的条件下,选取初始底物浓度分别为30,60,90和120g/L进行酶解试验,根据试验得出的水解度结果与其对应的动力学模型的计算结果进行比较,结果见图5.由图5可知,动力学模型计算出来的结果与试验结果,在酶解初始阶段相当吻合,但随着反应的进行,不同肽链长度的酶解产物对反应速率的抑制作用存在差异,从模型中计算出来的结果与实际试验结果就有了一定的差异.特别是当底物浓度比较低的时候,拟合结果要偏高,而底物浓度高时拟合结果则偏低.因此,在应用该模型时应注意ρE0/ρ0不能太高,也不能太低.3微生物酶解鸡蛋白的活性(1)木瓜蛋白酶较易失活,且符合一级失活模型,不同温度下的酶失活速率常数服从阿伦尼乌斯方程,木瓜蛋白酶在50到90℃范围内的酶热失活过程的活化能Ea为49.94kJ/mol.(2)在拟定假设下,通过L-B作图法求出了木瓜蛋白酶酶