uplc法测定姜和炮姜中姜酚的含量

uplc法测定姜和炮姜中姜酚的含量

生姜是姜科植物的一种生姜（魏岱。）是多年生草本植物。姜是常用的祭品。两者都是中医临床用途广泛的中药。二者功效有较大差别,干姜味大辛大热,主温中回阳,炮姜用于温中散寒温经止血。前人一直有“……干姜能走能守,炮姜守而不走”之说。现代研究表明姜酚(gingerol)是干姜中的辣味物质,也是干姜的主要生物活性成分,其种类有十多种,其中含量较高的为6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚,姜酚的化学性质极不稳定,在炮制中也会有些损失,了解姜酚类成分在炮制过程中的变化,对于认识其药性变化、了解其炮制前后的质量变化具有重要的意义。本文在文献研究的基础上,采用超高效液相色谱(UPLC)法,建立了同时、快速测定6、8、10-姜酚的测定条件,比较了干姜炮制前后的含量变化并对二者的质量进行了提高研究,结果表明,实验建立的方法快捷、简便、灵敏度高,准确性好,为干姜、炮姜的质量提高和炮制工艺的合理选择提供了一定的实验依据。1化合物及试剂WatersAcquityH-ClassUPLC超高效液相色谱仪,包括四元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器以及Empower2工作站;KQ3200DB型超声洗器(江苏昆山超声仪器有限公司);0.2μm微孔滤膜(上海陆纳生物科技有限公司);乙腈为色谱纯(TEDIA,USA);屈臣氏蒸馏水;乙醇等试剂均为分析纯。含量测定用姜酚对照品批号分别为:6-姜酚(23513-146),8-姜酚(23513-088),10-姜酚(23513-157);由鼎瑞化工(上海)有限公司,经1H-NMR、13C-NMR、MS、IR和UV等光谱鉴定其结构;按本方法色谱条件,归一化法测得它们的纯度分别为98.79%,98.81%,99.13%。干姜药材分别购于安徽合肥市的医院及零售药店,经安徽中医学院第一附属医院中药房李立华副主任药师鉴定均为姜科植物姜Zingiberofficinalies(Willd.)Rose.的干燥根茎;炮姜由干姜按照《中国药典》2010版(附录ⅡD)项下烫法要求炮制得到。2方法和结果2.1砂细砂的制备按照《中国药典》2010版(附录ⅡD)项下烫法要求,将已洗好的10倍药材量的细砂置入铁锅内,武火加热至微变色,炒至灵活状态,再加入大小、厚度接近的干姜片,不断翻动,炒至鼓起,表面棕褐色,急出锅,筛去砂、晾凉备用。2.2-姜酚溶液的配制精密称取6-姜酚1.58mg、8-姜酚1.44mg、10-姜酚1.08mg,精密称取,分别置于2mL量瓶中,加甲醇溶解并至刻度,摇匀,再分别精密吸取1.0、0.20、0.25mL定容至10mL,即得。2.3供试品溶液制备分别取干、炮姜粉末(过三号筛)约0.25g,精密称定,分别置具筛锥形瓶中,干姜精密加入75%甲醇20mL,超声(100W,40Hz)40min,炮姜精密加入50%甲醇20mL,超声(100W,40Hz)30min,放冷,称量,分别加75%、50%甲醇补足,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液。2.4酸水溶液比例流动相为乙腈-0.1%醋酸水溶液,梯度洗脱(乙腈–0.1%醋酸水溶液比例分别为0～1min,55:45;1～6min,65:35;6～7min,70:30;7～10min,90:10),流速0.25mL/min,柱温30℃进样量2.0μL,检测波长280纳米。2.5线性回归分析分别精密吸取6、8、10-姜酚的对照品溶液1.0,2.0,3.0,4.00,5.0μL,分别进样,测定峰面积,以各色谱峰面积分值(Y)对其浓度(X)进行线性回归,结果如表1。结果表明6-姜酚在79.0～395.0μg/mL;8-姜酚在14.4～72.0;10-姜酚13.5～67.5;范围内,与峰面积均成良好的线性关系。2.6仪器精密度试验吸取对照品溶液2.0μL,连续进样5次,6,8,10-姜酚峰面积的RSD(n=5)分别为0.27%,0.31%,0.90%,表明仪器精密度良好。2.7稳定性试验取供试品溶液,在0～12h内每隔2h进样一次,计算6,8,10-姜酚峰面积的RSD,结果分别为0.38%,1.90%,2.08%,表明供试品溶液在12小时内稳定。2.8样品中姜酚含量测定分别取上述对照品溶液和供试品溶液各2μL,注入超高效液相色谱仪,记录色谱图(见图1),以峰面积计算样品中6、8、10-姜酚的含量,见表2。2.9回收率的测定精密量取已测知含量的干姜药材(山东2)样品约0.1g共6份,分别置10mL量瓶中,加入各对照品溶液适量,按2.2项下处理溶液,用甲醇稀释定容,过0.2μm的微孔滤膜,取2.0μL续滤液注人液相色谱仪,测定,计算各成分回收率,结果见表3。3不同来源地用药前后化学成分的比较研究中药的药效是通过其所含化学成分群的综合作用而发挥的,因此建立中药评价质量标准时应考虑尽量多地选取含量测定对象,从而反映出其整体成分的情况。多组分多指标含量测定,对于全面控制药材的质量比单一成分测定更具科学性。《中国药典》2010版Ⅰ部干姜项下规定干姜和炮姜药材以6-姜酚含量分别不得少于0.050%,和0.30%,标准相对较低。同时测定3种姜酚类成分的含量,对与控制姜的质量更具合理性。中药经过炮制前后,所含的化学成分会在“质”、“量”两方面产生不同程度的改变,因而药性、功效、临床疗效发生随之而改变,这也是中医临床选择不同炮制品入药的依据。此外,炮制前后化学成分含量的变化是中药炮制研究的重要内容之一,其研究结果不但能阐明炮制原理,而且能指导炮制工艺的设计、改进和质量标准的制定。UPLC法与普通的HPLC比较具有分析时间快、灵敏度高等特点,在中药成分分析中应用越来越广泛。以往采用高效液相色谱进行干姜药材3种成分分析,完成l次进样分析就需要40min以上,而本研究采用UPLC方法,在8min内即可完成1次进样,可同时准确测定3种姜酚类成分的测定量。与HPLC相比,UPLC的分离效果和分析效率均有大幅度提高,本方法简单易行,需时较短,对于快速测定姜药材中多种姜酚类成分含量具有很好的可操作性。实验共考察了不同来源地4批干姜药材中3种姜酚的检测,并对炮制前后含量进行了比较。从测定结果可以看出,不同来源地干姜中3种姜酚含量差异明显,炮姜在炮制过程中3种姜酚的含量均有不同程度的降低提示姜酚类成分在炮制中含量的降低