鸡与牡蛎远缘杂交中的线粒体dna提取

鸡与牡蛎远缘杂交中的线粒体dna提取

鸡和仔猪的正交结合在美国、日本和马来西亚成功。通过手动输精技术，受精率为25%，孵化率为4%10%。我国于1992年10月也首次在石河子大学实验站杂交成功,填补了国内空白,且人工授精率达到35%,孵化率达到11%。远缘杂交可产生生产性能更优越的重组体,为培育一结合两亲本优点或产生特殊性能的新种群提供了可能。鸡与鹌鹑的反交迄今尚未成功。mtDNA作为核外遗传物质,弄清其本身的遗传作用及其与核遗传系统的相互关系,对探讨远缘杂交中性状遗传规律以及远缘杂交遗传机制等问题很有必要。鸡与鹌鹑生物学特性明显不同,自然情况下不可能存在杂交的情况,本研究采用人工授精的方法,获得了鸡与鹌鹑的属间杂交种,同时通过鸡、鹌鹑及其属间杂交种mtDNA-RFLP分析,探寻远缘杂交中核外遗传物质的遗传规律,对鸡与鹌鹑杂交的遗传基础进行了研究。1材料和方法1.1乌木糖杂交用亲本鹌鹑和种用蛋鸡购于石河子市北泉镇个体养殖户;乌鸡(♂)购于石河子市中心农贸市场;鹌鹑约7～9周龄,产蛋率已达75%。杂交用父本体格健壮,对按摩法采精反应较敏感、精液品质较好的蛋鸡和乌鸡。1.2不同的一、4次输精、2次输精杂交组合有蛋鸡(♂)×鹌鹑(♀)和乌鸡(♂)×鹌鹑(♀)。均采用人工输精技术。输精量为每只0.025mL原精液,选择给雌鹌鹑输精2次,雌鹌鹑产蛋集中在晚20:00-22:00之间,刚产完蛋,晚上22:00输1次精液,翌日早晨8:00输第2次精液。种蛋于第1次输精后的第3天开始收集,1周内入孵,孵化各个时期的温度、湿度采用鸡的孵化指标,孵化时间为20～23d。1.3心脏、肝脏和肝脏结合禽屠宰试验,收集杂交禽(6♂)、乌鸡(7♂,4♀)、蛋鸡(4♂,4♀)及鹌鹑(4♂,11♀)的心脏、肝脏和脾脏,共40只。为避免反复冻融,将新鲜内脏分割成小组织块各3份(1份提取线粒体DNA,2份备用),每份3g左右。1.4mtnda的电泳检测方法参见参考文献。本试验提取了各禽的mtDNA40只份。经电泳检测,选出24份(杂交禽6只全为雄性,其它禽雌、雄各3只),且电泳检测结果比较好的mtDNA样品。mtDNA浓度稀释至50ng/μL,-20℃冻存,备用。1.5mtd-a-phil分析1.5.1酶及缓冲液的应用限制性内切酶:BglⅠ、dralⅠ、EcoRⅠ、hincⅡ、HindⅢ、SalⅠ、HaeⅡ、TaqⅠ、PstⅠ等9种。以上9种酶及缓冲液中HaeⅡ、TaqⅠ、PstⅠ购自上海生工生物技术有限公司,其余购于华美生物公司,各酶序列见表1。将酶分装,并用Taq酶稀释液按10∶1稀释,-20℃贮存备用。1.5.2酶为taq5反应体系:10×buffer2μL;BSA2μL;底物13μL;酶稀释液3μL;反应体积20μL。反应条件:TaqⅠ65℃,其余酶为37℃,水浴。反应时间:2～4h;终止反应:-20℃下放置20min。1.5.3凝胶电泳测定酶切反应终止后,取出反应样品,待反应管温度至室温后,加入3μL电泳前沿指示剂,混合均匀,在以1×TAE配制好的0.8%的琼脂糖凝胶上上样、电泳,为方便起见,在制胶过程中加EB于凝胶中(EB含量0.5mg/L),以2～3V/cm电压,电场强度65mA下电泳,待前沿指示剂接近凝胶边缘(凝胶长度约7cm,时间2～2.5h)后,停止电泳,取出凝胶于White/ultravioletTransilluminatorProducts凝胶电泳图象分析设备拍摄、存贮图片,之后于GDS-7600凝胶成像系统中观察,记录mtDNA谱带供分析用。1.5.4dna的遗传相似性及扩增性以lamdaDNA/HindⅢ及lamdaDNA/HindⅢ+EcoRⅠMarker作为相对参照分子量标记,利用LabworkstmAnalysisSoftware(Ver3.0forwindows95/NT)中的DNA分析软件,推算出各个酶切片段的相对分子质量和各类禽线粒体DNA的大小。利用Nei和Li遗传多态性,任两DNA序列的遗传相似性:F=2NXY/(NX+NY)两类群间的遗传距离:P=1-[(F2+8F)1/2]1/rNX、NY分别为群体X、Y的限制性片段数;NXY:两者间片段共享数;F:两群体间限制性片段共享度;P:两群体间的遗传距离;r:RE酶识别序列碱基长度。2结果与分析2.1培养过程中长丝件多、分离、放表2中,公鹑与母鸡交配没有产生受精蛋、公鸡(不包括乌鸡)与母鹑交配产生了1275枚受精蛋,将受精蛋剖解可见受精卵形成了多细胞结构的胚盘,胚盘中央有较薄、透明的明区,周围有较厚的不透明的暗区。正交试验组合受精率为53%,试验效果显著高于焦丽萍报道的结果(约35%)。根据多批重复测定结果来看,鸡与鹌鹑属间杂交其受精率受季节、精液组合、输精时间、母禽在产蛋周期中所处的阶段等因素的影响比较大:受精率在春秋季节高于夏冬季节;原精液∶尾脂腺分泌物(5∶1)组合高于原精液组合;给母鹌鹑输精2次,所得到的受精率比焦丽萍所做结果有明显提高;母禽在产蛋高峰期时输精的受精率高于非产蛋高峰期时的受精率。而适量的公鹑泄殖腔腺分泌的泡沫状物与公鸡精液的组合能缓解鸡精液被异属母鹑生殖道内环境的排斥作用,表明公鹑腺分泌的泡沫状物可能对公鸡精液的获能有作用。属间杂交试验的出雏率很低。反交组为0、正交组为14.2%左右,说明两杂交组合中分别有100%和85.8%的受精卵在胚胎发育过程中逐渐死亡。在反交组合中,对入孵蛋剖解表明,极少的受精胚仍处于胚盘状态,无进一步分化生长的迹象。正交组合中胚胎死亡的比较多,检查孵化2.8～7d的受精蛋,观察表明仅1/3为明显有血环的活胚,其余的则停止发育,15个3日龄子一代胚胎有10个明显有血环形成,但其透明带几乎没有分化,另5个出现了不正常的细胞分化,为细胞团块,在第4天观察胚胎时,发现胚胎的死亡率接近1/2,表明胚胎死亡主要集中在2.8～4d,胚胎发育至晚期死亡的现象比较少,在多批孵化试验中,无一枚晚期死亡的胚胎。这与日本所做同类研究报道的结果相一致——胚胎入孵的2～3d后部分胚胎开始死亡。从理论上推测鸡与鹌鹑的正交组合的最大孵化率只能为50%。2.2鸡线虫dna的大小利用LabworkstmanalysisSoftware(Ver3.0forwindows95/NT)推算出各禽线粒体DNA的大小分别为:乌鸡、鸡19.1kb,鹌鹑16.9kb,杂交禽16.9kb。2.3mtnda单倍型的筛选本试验用9种限制性内切酶酶解各禽线粒体DNA,其中有6种酶EcoRⅠ、DralⅠ、HincⅡ、SalⅠ、HaeⅡ、TaqⅠ经琼脂糖凝胶电泳检测出了多态性。遗憾的是,HaeⅡ及TaqⅠ的酶切位点比较多(HaeⅡ至少6个),各片段比较小,用0.8%琼脂糖凝胶电泳,不能清晰地辨别态型,有必要增大胶的浓度和改变Marker或采用聚丙烯酰胺凝胶电泳再进行检测。EcoRⅠ、DralⅠ、HincⅡ、SalⅠ4种酶共检测出24个不同的酶切片段,归纳为8种限制性态型(Restrictionmorph)。4种酶在不同家禽线粒体DNA中均出现了变异,其中EcoRⅠ、HincⅡ的A型比B型少了1个位点;SalⅠ的A型比B型少了2个位点;DralⅠ的A型比B型多了1个位点。在DralⅠ的A、B两态型中分别有2个大小相同的酶切片段;而在HincⅡ的A、B两态型中有1个大小相同的酶切片段,EcoRⅠ和SalⅠ的各种限制性态型中均无大小相同的酶切片段。各酶的限制性态型、片段大小见表3和图2。用上述4种内切酶完全酶切鹌鹑和杂交禽的mtDNA,由酶切结果看,4种酶消化两类家禽的位点数都分别都为1、6、4、1,这2种mtDNA的酶消化结果完全相同(见图2),而且计算出来的片段分子量大小几乎完全相同,总和约16.9kb。同一酶酶切,两类禽表现出相同的限制性酶切多态型,即杂交禽的线粒体DNA与鹌鹑的线粒体DNA未检测出多态性。通过Nei氏片段法计算,2种单倍型间的片段共享度F=0.25,遗传距离P=0.0834。综合各种酶的限制性态型,可将每一种mtDNA进行分型,此即mtDNA单倍型(mtDNAhaplotype)。在24只受试个体中,只检测出2种mtDNA单倍型(表4)。6只杂交禽与6只母本鹌鹑个体的mtDNA单倍型均表现为Ⅰ型,父本鸡、乌鸡12只个体mtDNA表现为Ⅱ型。3鸡属、社会主义核心病毒种的杂交分析3.1鸡与鹌鹑属间杂交后代胚胎死亡较多,且大部分发生于胚胎发育的早期,与日本所做同类研究报道的结果一致。Yoshihiro报道,鸡与鹌鹑进行属间杂交,受精蛋入孵3～5d部分胚胎出现死亡,且均为雌性胚胎,5～8d后雌性胚胎将全部死亡,表明异属家禽精卵结合后,并不能比较理想地孵化出杂交子一代。由于两不同属的家禽染色体重组、配对,很有可能造成杂交种不育或单性不育。在其他物种属间杂交试验研究中,杂交子一代也表现出不同程度的杂交种不育或单性不育现象。根据本次试验结果及杂交禽的行为、外貌特征及生理解剖观察发现,所获得的杂交禽确实均为雄性,而且至23周龄时其生殖器官发育仍不完全。由此不难看出,鸡与鹌鹑属间杂交,杂交后代极有可能表现出杂交子一代单性不育——雌性不育,且不育的程度比较大,即在雌性胚胎发育的早期细胞分化活动就得以终止。所以从理论上推测鸡与鹌鹑的正交组合的最大出雏率只能为50%。3.2鸡属、鹑属群间的遗传差异可直观、明显地表现在线粒体DNA片段大小不同。鸡属mtDNA约19.1kb,鹌鹑属mtDNA约16.9kb。限制性内切酶识别一段特异的核苷酸序列,并切割它。对特定的内切酶,酶切位点的数目及其位置随核苷酸序列的不同而不同。用于比较的两种DNA序列的相似性越高,限制性切割谱带也越接近。反之根据限制性切割谱带的差异程度,我们可以大致估计两种DNA序列的同源性。鸡、乌鸡与鹌鹑在动物学分类上属于两个不同的属,亲缘关系较远;比较两种禽mtDNA,限制性酶切谱带,二者差异比较大:同一酶酶切两属家禽切点数不同,EcoRⅠ、DralⅠ、HincⅡ、SalⅠ在鸡属mtDNA上分别有2,5,5,3的切点,而在鹌鹑mtDNA上分别有1,6,4,1个切点;各切点所切片段在限制性酶切谱带上的位置不同,即酶切片段的大小也不相同。对于鸡与鹌鹑远缘杂交的产物,其mtDNA经EcoRⅠ、DralⅠ、HincⅡ、SalⅠ酶切,分别有1,6,4,1个切点,所产生的限制性酶切谱带与母本完全相同,与父本差异较大。3.3在