巴西蛇毒病毒基因-二肽羧肽酶抑制剂的研究进展

巴西蛇毒病毒基因--二肽羧肽酶抑制剂的研究进展

正如图1所示，captobal含有丙酸，化学名称为（2s）-1-（3-甲基-2-甲基-1-氧代-丙基）-l-优质氨基酸，英化学名称为[（2s）-1-（3-甲基-2-meth-1-oxo-propcil-1）-l-proline]。卡托普利为白色结晶或结晶性粉末,熔点为104～110℃;在甲醇、乙醇或氯仿中易溶,在水中溶解;比旋度为-126°～-132°。1965年Ferreira对巴西毒蛇Bothropsjararaca的毒液进行研究,发现该毒液的主要成分可以抑制血管舒缓激肽(bradykinin)的降解。Squibb的研究人员发现该毒液的主成分是一个简单的九肽teprotide,临床试验显示这种九肽对血管紧张素转化酶(ACE)具有特异的抑制作用,并且还具有降压作用。由于口服无效,因此并不是一个好的新药开发先导化合物。ACE(二肽羧肽酶)是一个利用单羧肽酶,即羧肽酶A(carboxypeptidaseA,CpdA)作为替代模型的金属酶。早期研究结果表明,ACE的所有肽抑制剂都具有一个C-末端脯氨酸,再加上苄基琥珀酸是一个特异的CpdA抑制剂的这一事实,从而合成了一系列羧基链烷醇和巯基链烷醇的脯氨酸酯。它们均显示了良好的ACE抑制活性,其中化合物SQ14225被开发成最早的ACE抑制药,即卡托普利(Captopril)。1977年,卡托普利由美国施贵宝(Squibb)公司研制成功,1981年,卡托普利在德国首先上市,主要用于治疗各种原发性高血压,具有起效迅速、降压平稳、远期疗效突出等优点,同时对心力衰竭和糖尿病、肾病也有良好的治疗效果。卡托普利的开发成功,极大地促进了ACE抑制剂研究,自80年代中期以来,已有依那普利、阿拉普利、西拉普利、贝那普利、螺普利、替莫普利、群多普利、地拉普利、咪多普利、福辛普利、赖诺普利、莫西普利、喹那普利、培多普利和雷米普利等多种药物相继上市,为高血压等疾病地治疗开辟了崭新的途径。时至今日,以卡托普利为开端的ACE抑制剂的研究,仍是药物化学研究的热点领域之一。尽管ACE抑制剂、钙离子通道拮抗剂、血管紧张素II受体拮抗剂等各类抗高血压新药层出不穷,卡托普利仍在高血压的临床治疗中扮演着重要的角色。由于卡托普利具有临床应用广泛、经济效益明显等特点,其合成方法的研究引起了各国学者的广泛关注,尝试设计了多条合成路线。根据构建酰胺碳-氮键与实现2位碳原子构型要求的先后顺序的不同,卡托普利的合成方法可分为两类:一类是先形成酰胺碳-氮键,后完成2S与2R构型化合物分离的方法;另一类是先制备2S构型的侧链,后形成酰胺碳-氮键的方法。1合成卡托普利类似物1977年,Ondetti等公开了第一种合成卡托普利的方法,将L-脯氨酸与氯甲酸苄酯反应保护胺基,在与异丁烯在浓硫酸催化下加成形成叔丁酯保护羧基。在Pb/C催化下氢解除去氨基保护基,所得化合物与3-乙酰基硫代-2-甲基丙酸的外消旋混合物反应得到胺基酰化产物。经水解除去羧基保护基后,与二环己基胺成盐,分离得到2S构型的异构体,再经过脱盐、水解除去巯基保护基,得到卡托普利,如图2。其突出的特点是在合成的初始阶段要对L-脯氨酸的氨基和羧基分别进行保护,待相应反应结束后再去除保护基。由于保护基的引入,减少了副反应发生的可能性,有利于得到高纯度的目标产物,但同时也增加了反应步骤,使总收率降低。1980年,Ondetti等将N-叔丁氧基羰基脯氨酸与氯甲酸乙酯、硫氢化钠反应得N-叔丁氧基羰基硫代脯氨酸,该化合物与2-甲基丙烯酸加成,以三氟乙酸脱除保护基后,经DCC脱水环合得到双环化合物的差向异构体,该化合物经水解、分离等步骤可制备卡托普利,如图3。该路线的特点是在反应过程中形成双环中间体,在水解断裂碳-硫键,可同时得到羧基和巯基。此路线是ACE抑制剂研究早期使用的合成卡托普利及其类似物的方法之一,设计构思巧妙,但反应收率不理想。二十世纪80年代常州制药厂首先实现卡托普利的国产化,应用的合成路线为:用2-甲基丙烯酸为原料,与硫代乙酸进行加成反应,制备3-乙酰基硫代-2-甲基丙酸的外消旋混合物,经二氯亚砜氯化得到3-乙酰基硫代-2-甲基丙酰氯的外消旋混合物,再与L-脯氨酸反应制得1-(3-乙酰基硫代-2-甲基-1-氧代-丙基)-L-脯氨酸混旋物,与二环己基胺成盐,分离得到2S构型的二环己基胺盐,再经脱盐、水解去乙酰基,得到卡托普利,如图4。该路线具备原料廉价易得、反应收率较高及2S和2R差向异构体成盐分离效果良好等优点。但是,其缺点也是不容忽视的,首先,原料硫代乙酸通常需要使用硫化氢来制备,对环境造成一定的污染;其次作为副产物的(2R)-1-(3-乙酰基硫代-2-甲基-1-氧代-丙基)-L-脯氨酸并无合适的方法进行异构化或消旋化转化为2S体,只能将它水解回收L-脯氨酸。1980年,Inke将L-脯氨酸用2-甲基-2-丙烯酰氯酰化,产物和硫代乙酸进行加成反应,得到1-(3-乙酰基硫代-2-甲基-1-氧代-丙基)-L-脯氨酸混旋物,与二环己基胺成盐,分离得到2S构型的二环己基胺盐,再经脱盐、水解去乙酰基,得到卡托普利。由于此路线仍需使用硫代乙酸,仍无法回避2R异构体的产生,同时加成反应收率并不理想,工业化价值不大。如图5。刘仁勇,陈玉彬对方法四进行改进,在得到乙酰卡托普利二环己胺盐后,经氨水、双氧水反应后得到卡托普利二硫化物,再经锌粉还原得到卡托普利,如图6。1984年,Nam等报道,将2-甲基丙烯酸与氯化氢发生加成反应得到3-氯-2-甲基丙酸,经二氯亚砜氯化得到3-氯-2-甲基丙酰氯,酰氯与L-脯氨酸缩合得到1-(3-氯-2-甲基-1-氧代-丙基)-L-脯氨酸混旋物,与二环己基胺成盐,分离得到2S构型的二环己基胺盐,再经脱盐、取代反应得到卡托普利,如图7。也可以用溴化氢代替氯化氢与2-甲基丙烯酸加成。此法经氯代和硫氢酸氨取代引入巯基,无需使用硫代乙酸,避免了在硫代乙酸生产过程中硫化氢对环境的污染。此路线的不足之处在于仍有2R异构体的产生,L-脯氨酸单耗大。WO9002732报道,以2-甲基丙烯酸为原料,与吡咯烷和二硫化碳加成引入巯基,再用二氯亚砜将羧基转化为酰氯,再与L-脯氨酸反应形成酰胺键,该化合物在甲氧基乙醇中重结晶,得到2S构型产物,再经水解得到卡托普利,如图8。此方法通过吡咯烷与二硫化碳对双键的加成导入巯基,避免了硫代乙酸的使用;所得化合物为2S和2R差向异构体的混合物,不需要与有机碱成盐,直接通过重结晶便可得到2S体的纯品,大幅度地简化了操作,总收率也有一定的提高。此路线同样不可避免有2R异构体的产生,L-脯氨酸单耗大等不足之处。谢美华、宁奇对方法(3)进行改进,将3-乙酰基硫代-2-甲基丙酰氯和L-脯氨酸在水或乙醇、丙酮、四氢呋喃等溶剂中反应,直接结晶得到(2S)-1-(3-乙酰基硫代-2-甲基-1-氧代-丙基)-L-脯氨酸,再水解得到卡托普利,如图9。此方法不需采用任何试剂进行光学异构体的分离,极大地简化了生产工艺,减少原料成本和生产工时。但此路线仍有2R异构体的产生,需水解回收L-脯氨酸。2-乙酰基硫代-2-甲基丙酸法先形成酰胺碳-氮键,后完成2S与2R构型化合物分离的路线有一个共同的问题无法避免,那就是2R构型化合物无法消旋化,只能水解回收L-脯氨酸。为了解决这一问题,近年来,先制备2S构型的侧链,后形成酰胺碳-氮键的路线成为人们研究的热点。该类路线的关键在于2S构型的3-取代-2-甲基丙酸衍生物的制备。Robison等人以手性化合物2S-甲基-3-羟基丙酸为原料在DMF中使用二氯亚砜为氯化剂同时氯化羟基和羧基制得2S-甲基-3-氯-丙酰氯,再与L-脯氨酸进行酰化,所得氯化物与NaHS反应便可制得卡托普利,如图10。原料2S-甲基-3-羟基丙酸可由异丁醇、异丁醛或异丁酰胺等通过微生物发酵法制备。该方法避免了2R异构体的产生,从而大幅度降低了L-脯氨酸的消耗;巯基的引入在整个路线的最后一步进行,所用的试剂为硫氢化钠,无需使用硫化氢,减少了对环境的污染。研究人员通过化学法将3-乙酰基硫代-2-甲基丙酸拆分得到(2S)-3-乙酰基硫代-2-甲基丙酸,再经二氯亚砜或乙二酰氯氯化制得酰氯,与L-脯氨酸反应,经水解除去乙酰基得到卡托普利,如图11。该法所用的拆分试剂一般是手性有机碱,手性有机碱与3-乙酰基硫代-2-甲基丙酸成盐后,结晶拆分,得到2S构体。该路线解决了L-脯氨酸单耗大的问题,但所选用的拆分试剂必须符合廉价且可回收套用等条件,才能应用于工业生产。以上方法的欠缺是仍无法回避3-乙酰基硫代-2-甲基丙酸生产给环境带来的污染。Howell等人以及中国的高向东,顾炎等人通过酶法将3-乙酰基硫代-2-甲基丙酸拆分得到(2S)-3-乙酰基硫代-2-甲基丙酸,然后通过氯化、缩合、水解等步骤得到卡托普利,如图12。所用的酶可以是脂肪酶或胰酶。该法主要问题是目前市售酶的活性不高,拆分效果不理想,尚不具备工业化应用的条件。Schneider等人以2-甲基-3-溴丙酸的2R、2S混旋体为原料,与硫氰酸钾反应,得到2-甲基-3-氰硫代丙酸,该化合物与(S)-甲基苄基胺成盐拆分,得2(S)-甲基-3-氰硫代丙酸。2(S)-甲基-3-氰硫代丙酸与L-脯氨酸在氯甲酸异丙酯的作用下,形成酰胺键得(2S)-1-(3-氰基硫代-2-甲基-1-氧代-丙基)-L-脯氨酸,再经过Pb/C催化氢化制备卡托普利,如图13。此路线是近年报道的合成卡托普利的一个重要方法,具有原料廉价、操作简便、收率较高等优点,是工业化生产的可行途径之一。Patel等以及Sakimae等两个小组以3-乙酰基硫代-2-甲基丙酸甲酯的外消旋混合物为底物,使用特定的假单胞菌(Pseudomonas)专一性的催化水解外消旋混合物中的2S体,同时对2R体毫无影响,从而实现了两种异构体的拆分。Patel小组可以使(2S)-3-乙酰基硫代-2-甲基丙酸的化学收率达到46%,光学纯度达98%e.e.。Hond等人报道,使用3,4-二氢香豆素水解酶(3,4-dihydrocoumarinhydrolase)也可以选择性的水解3-乙酰基硫代-2-甲基丙酸甲酯的外消旋混合物中的2S体,(2S)-3-乙酰基硫代-2-甲基丙酸的化学收率可达到49%,光学纯度大于99.9%e.e.。更令人振奋的是,据Sakimae等报道,据余下的(2R)-3-乙酰基硫代-2-甲基丙酸甲酯还可以用1,8-二氮双环十一-7-烯(DBU)进行化学消旋化。于是可以得到如图14所示的卡托普利合成路线。这一路线具有立体选择性强,反应条件温和,化学收率较高,产物光学纯度好,对环境的污染较小等优点,是一个具有良好应用前景的卡托普利制备途径。尤其是由于(2R)-3-乙酰基硫代-2-甲基