利用双水平法制备乌梅低聚肽的研究

利用双水平法制备乌梅低聚肽的研究

genwall是中国的一种独特鸡，含有丰富的营养成分，是高质量蛋白质的来源。通过酶解制得乌鸡低聚肽,能够释放出乌鸡蛋白质中的活性肽段。低聚肽具有吸收快、耗能低、易于被人体消化和吸收等特点,对乌鸡的开发利用具有重要的意义。但乌鸡低聚肽作为食品原料,加工条件是否影响其稳定性目前尚不明确。因此,本文以乌鸡为原料制备乌鸡低聚肽,在对其基础理化成分进行分析的基础上,以分子量分布为指标,研究温度、pH值和蛋白酶消化对乌鸡低聚肽稳定性的影响,以期为其在食品工业中的应用提供理论依据。1材料和方法1.1材料和机器1.1.1白酶、盐酸、碱乌鸡:市售;碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶:诺维信生物技术有限公司;盐酸、氢氧化钠:北京化工厂,分析纯;乙腈:美国Fisher公司,色谱纯;三氟乙酸:英国AlfaAesar公司,分析纯。1.1.2喷雾干燥机TJ12-H绞肉机:广东恒联食品机械有限公司;RJT03匀浆机:北京市和莫机电研究所;YG30喷雾干燥机:无锡市阳光干燥设备厂;FE20K型pH计:瑞士梅特勒-托利多公司;HH-4数显恒温水浴锅:普瑞斯机械有限公司;LC-20AD型高效液相色谱仪、凝胶色谱柱(TSKgelG2000SWXL300mm×7.8mm):日本岛津公司。1.2方法1.2.1果汁酶解果汁alcarlog的制备将乌鸡除去内脏后,用水洗净,切块后称取2kg,用绞肉机绞碎,分多次加适量水用匀浆机匀浆。转移到酶解罐中,用蒸馏水定容至6L。用NaOH溶液调节pH值为8.5,升温恒定至60℃后,以每克蛋白质3000单位的酶量加入Alcalase2.4L,酶解2h。之后调节pH值为7.0,温度为60℃,以每克蛋白质2500单位的酶量加入木瓜蛋白酶,酶解2h。酶解结束后,升温至100℃,保持10min,灭酶。冷却后6000r/min离心15min,取上清液。用截留分子量为2×106u的陶瓷膜过滤2～3h,以虹吸方法吸出中间清液,弃去上层油脂。然后用截留分子量为1000u的超滤膜超滤,得到分子量小于1000u的滤过液,将滤过液喷雾干燥,进口温度220℃,出口温度200℃,转速40r/min,得到乌鸡低聚肽干粉。1.2.2水分含量、灰分含量、脂肪含量测定蛋白质含量测定采用GB/T5009.5规定方法,水分含量测定采用GB/T5009.3规定的方法,灰分含量测定采用GB/T5009.4规定的方法,脂肪含量测定采用GB/T5009.6规定的方法。1.2.3检测波长和流速将样品经孔径0.2μm聚四氟乙烯过滤膜过滤后,用高效液相色谱仪进行凝胶过滤。流动相:乙腈:水:三氟乙酸,45:55:0.1(v/v/v);检测波长:220nm;进样体积:10μL;流速:0.5mL/min;柱温:30℃,利用紫外检测器检测,使用GPC软件处理数据。5种肽标准品为乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(分子量189)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子量451)、杆菌酶(分子量1450)、抑肽酶(分子量6500)、细胞色素C(分子量12500),配制成0.1%(m/v)溶液,过膜后进样,用来制作相对分子量校正曲线。1.2.4水浴温度和时间用蒸馏水溶解乌鸡低聚肽干粉,配制成浓度为2mg/mL的溶液,分装至5支50mL离心管,置于水浴锅中,分别在20、40、60、80、100℃下水浴,2h后冷却至室温,分别检测其分子量分布。1.2.5ph对离心系数的影响用蒸馏水溶解乌鸡低聚肽干粉,配制成浓度为2mg/mL的溶液,分装至5支50mL离心管中,分别用1mol/LHCl和1mol/LNaOH调节各管pH为2、4、6、8、10,在37℃的水浴锅中放置2h,冷却至室温后分别检测其分子量分布。1.2.6外部模拟对胃肠胃的消化实验1.2.6.消化前对照处理用蒸馏水溶解乌鸡低聚肽干粉,配制成浓度为2mg/mL的溶液,将40mL溶液置于50mL离心管中,用1mol/LHCl调节pH为2,在37℃的水浴锅中预热片刻,加入3%(E/S)胃蛋白酶,混匀后迅速取出样品20mL于另外1支50mL离心管,沸水中灭酶活10min,以此作为样品消化前对照。取出后,将剩余20mL样品置于37℃水浴锅中消化3h,沸水中灭酶活10min,冷却至室温后分别检测消化前后的样品分子量分布。1.2.6.样品的消化用蒸馏水溶解乌鸡低聚肽干粉,配制成浓度为2mg/mL的溶液,将40mL溶液置于50mL离心管中,用1mol/LNaOH调节pH为6.8,在37℃的水浴锅中预热片刻,加入3%(E/S)胰蛋白酶,混匀后迅速取出样品20mL于另外1支50mL离心管,沸水中灭酶活10min,以此作为样品消化前对照。取出后,将剩余20mL样品置于37℃水浴锅中消化3h,沸水中灭酶活10min,冷却至室温后分别检测消化前后的样品分子量分布。1.2.6.不同的胰蛋白酶样品及消化前对照按照1.2.6.1的方法进行胃蛋白酶消化后,用1mol/LNaOH调节pH为6.8,在37℃的水浴锅中预热片刻,加入3%(E/S)胰蛋白酶,混匀后迅速取出样品20mL于另外1支50mL离心管,沸水中灭酶活10min,以此作为样品消化前对照。取出后,将剩余20mL样品置于37℃水浴锅中消化3h于沸水中灭酶活10min,冷却至室温后分别检测消化前后的样品的分子量分布。2结果与讨论2.1各项功能含量通过蛋白酶解制备的乌鸡低聚肽中,总蛋白质含量很高,占82.26%,其余成分含量较少,其中水分含量为4.95%,灰分含量为7.59%,脂肪含量为0.73%。可见乌鸡低聚肽含有较高的蛋白质,是一种优质的蛋白质物质。2.2分子量分布的变化热处理是食品加工中常用的方式,本研究考察了不同热处理温度对乌鸡低聚肽热稳定性的影响。乌鸡低聚肽经过不同的温度处理后,其分子量分布凝胶色谱图如图1所示。乌鸡低聚肽分别在20、40、60、80、100℃水浴2h之后,分子量分布凝胶色谱图基本没有变化。利用GPC软件处理后,分子量分布数据如表1所示。各个分子量区间的比例变化不超过2%,分子量小于1000u的总含量均在90%。这表明在加工过程中,温度的变化对乌鸡低聚肽组分的影响很小,因此在加工中不必担心产品外观和性质的改变。陈亮等考察了玉米低聚肽在不同温度条件下的热稳定性,与本研究结果一致,玉米低聚肽组分中分子量在1000u以下的总含量基本没有变化,具有较好的热稳定性。2.3不同ph对鸡低聚肽组分的影响酸碱处理是食品加工中常用的技术手段。乌鸡低聚肽经过不同的pH值处理后,其分子量分布凝胶色谱图如图2所示,乌鸡低聚肽在pH值分别为2、4、6、8、10的条件下水浴2h之后,分子量分布凝胶色谱图基本没有变化。利用GPC软件处理后,分子量分布数据如表2所示,各个分子量区间的比例变化不超过2%,分子量小于1000u的总含量均在90%。这表明乌鸡低聚肽在广泛的pH范围内有良好的稳定性,因此在加工过程中,pH的变化对乌鸡低聚肽组分的影响很小。王若敏等对大豆肽的酸碱稳定性进行了研究,结果表明在不同pH值下,大豆肽的分子量分布没有显著性差异,与本文结果一致。2.4分子量分布情况本研究模拟人体的胃肠消化情况,对乌鸡低聚肽进行了体外消化稳定性实验。乌鸡低聚肽样品分别经胃蛋白酶、胰蛋白酶、先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化后,其分子量分布凝胶色谱图如图3所示。从该图3可以看出,经过不同的消化模式,乌鸡低聚肽分子量分布凝胶色谱图基本上没有变化。利用GPC软件处理后,分子量分布数据如表3所示,乌鸡低聚肽的组分中分子量小于1000u的总含量略有升高,但升高不到4%。体外消化实验中,消化时间为3h,与人体胃肠消化的实际情况接近。这表明乌鸡低聚肽能够耐受胃肠道中胃蛋白酶和胰蛋白酶作用。3鸡低聚肽的稳定性通过两步酶解法制备出乌鸡低聚肽,含有较高的蛋白质,是一种优质的蛋白质物质。经过不同的温度、pH值和体外模拟胃肠道消化实验,乌鸡低聚肽中分子量小于1000u的总含量均在90%,各个分子量区间变化均不明显,这表明乌鸡低聚肽具有良好的热稳定性、pH稳定性以及消化稳定性,在食品加工过程中,能够保持较好的稳定性,有利于保健食品的开发和利用,并且被人体摄入后,能够耐受胃肠道中胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用,可能在体内发挥原有的生理活性。与未消化对照组相