高效液相色谱法同时测定碧螺春茶中5种成分

高效液相色谱法同时测定碧螺春茶中5种成分

碧螺春是中国十大名茶之一。位于江苏省苏州市太湖洞庭东山和西山。它以其色泽、香气、口感和口感而闻名，也是国内外的著名茶。同其他的绿茶一样,碧螺春茶中含有咖啡因和大量的茶多酚。茶多酚是绿茶中的主要活性成分,在绿茶中占15%～30%。儿茶素是茶多酚的主要组分,是良好的抗氧化剂,具有生物活性和抗肿瘤、抗诱变、预防龋齿等诸多药效,因而茶多酚已作为一类重要的食品添加剂和药物,越来越受到人们的关注。茶多酚中以儿茶素类成分含量居多,其质量分数占茶多酚总量的90%左右。儿茶素类化合物主要包括没食子儿茶素(GC)、表儿茶素(EC)、儿茶素(C)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸(ECG)和表没食子儿茶素(EGC)等。目前,对茶叶中儿茶素的研究较多,但对碧螺春茶叶中主要活性成分,尤其是茶多酚类含量的研究未见报道。以往研究茶多酚所采用的方法主要有紫外吸收法、薄层色谱法、毛细管电泳法、高效液相色谱法(HPLC)等,从灵敏度、准确度上看,HPLC是目前测定儿茶素成分的首选方法,但往往存在着样品前处理繁琐、流动相系统复杂、预分离的组分间分离度不高、样品分析时间过长等因素,给分析结果带来很大的误差。笔者在总结前人研究结果的基础上,以碧螺春茶为样本,探索出新的样品提取方法和色谱分离条件,使得样品中所有儿茶素类化合物均得到良好的分离,且操作更简便、更准确,经过大量的样品测试,该方法不仅适用于碧螺春茶,同样也可以测定其他绿茶、茉莉花茶以及红茶中儿茶素类成分的含量,为茶叶的等级评价和质量控制提供科学依据。1材料和方法1.1甲醇、乙腈、甲醇各等级碧螺春茶由苏州东山吴侬碧螺春茶厂提供。LC-10A高效液相色谱仪、SPD-2AS紫外检测器(日本岛津),U6K进样阀(Waters),CSF-1A超声波清洗器(常州市超声波设备厂)。甲醇、乙腈为色谱纯(美国TEDIA公司生产),冰醋酸为AR级试剂,水为二次蒸馏水。没食子儿茶素((-)-gallocatechin,GC,纯度为98%,Sigma),表没食子儿茶素((-)-epigallocatechin,EGC,纯度为98%,Sigma),表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-epigallocate-chingallate,EGCG,纯度为98%,Sigma),表儿茶素没食子酸((-)-epicate-chingallate,ECG,纯度为98%,Sigma)和咖啡因(caffeine,CAF,Sigma)。1.2对照品溶液的制备精密称取GC、EGC、EGCG、ECG和CAF对照品适量,置于10ml容量瓶,加95%乙醇制成分别含0.071mg/mlGC、0.050mg/mlEGC、0.214mg/mlCAF、0.137mg/mlEGCG和0.148mg/mlECG混合对照品溶液。1.3乙醇提取的工艺路线取茶叶粉碎并过60目筛,精密称取约0.5g粉末,加80℃热水100ml,超声提取30min,过滤,滤渣再分别以60%乙醇80ml、95%乙醇60ml重复上述步骤提取2次,合并3次提取液,加水定容至250ml量瓶中,摇匀。取上清液过0.45μm微孔滤膜,作为供试品溶液。1.4流动相及洗脱流程色谱柱:ShimpakC18(150.00mm×4.6mm,5μm,岛津公司);流动相:A为乙腈,B为0.2%冰醋酸溶液,梯度洗脱,洗脱程序见表1;流速:1.0ml/min;柱温:30℃;检测波长:280nm。2结果与分析2.1af、ecgg、ecg的保留时间取供试品溶液10μl进样,记录色谱图,GC、EGC、CAF、EGCG和ECG的保留时间分别为6.37、21.69、24.98、32.46和46.31min,各峰与相邻峰的分离度均大于1.5。对照品及供试品的色谱如图1、2所示。2.2各成分线性回归分析分别精密吸取混合对照品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5和15.0μl,进样测定。同一体积的样品平行分析3次,取其平均值。以峰面积(Y)为纵坐标,进样量(X,μg)为横坐标作图,得到各成分的线性回归方程(表2)。由表2可知,当混合对照品进样在2.5～15.0μl时,也即GC、EGC、CAF、EGCG、ECG5种成分的进样量分别在0.1775～1.0650、0.1250～0.7500、0.5350～3.2100、0.3425～2.0550、0.3700～2.2200μg范围内与色谱峰面积的线性关系良好(r=0.9993～0.9999)。2.3h预后样分析取新制备的同一批碧螺春茶供试品溶液,分别在室温下放置0、1、2、4、8h后进样分析。GC、EGC、CAF、EGCG和ECG峰面积的相对标准偏差分别为0.92%、0.84%、1.28%、1.24%和1.01%,表明供试品溶液在8h内稳定。2.4加样回收率和精密度试验取9份已知含量的碧螺春茶提取液各100μl,分为3组,每组3份。每组样品中分别精密加入混合对照品溶液80、100、120μl,按所建立的方法进行供试品溶液的制备和测定,计算GC、EGC、CAF、EGCG和ECG含量,计算各组分的回收率及精密度。表3结果表明,所有组分的回收率在98.60%～100.19%,RSD均小于1%,说明该方法准确可靠。2.5品溶液的进样分析分别取6批不同等级的洞庭碧螺春茶,按“1.3”下的方法操作,取供试品溶液5μl进样分析,并计算其中5种成分的含量。由表4可知,等级越高质量越好的碧螺春茶,其含有的GC、EGC、ECG相对均较高,CAF没有太大的差别,而EGCG含量随着采摘时间滞后,略有上升的趋势。3讨论3.1不同浓度儿茶素类及教学产物的吸收取5种对照品混合溶液,用紫外-可见分光光度计在波长200～400nm内进行扫描,结果发现,儿茶素类及咖啡因成分在210和280nm均有较强吸收。但考虑到在210nm测定提取液样品,重现性较差且杂峰干扰较大,所以选用280nm作为检测波长。3.2流动相的选择前期的研究工作证明,茶多酚类化合物组成复杂,各成分间极性相差较大,且测定中干扰成分较多,曾选择了多种等度洗脱流动相,分离效果均不理想,因此选择了梯度洗脱。流动相分别选择乙腈-水(冰乙酸)、乙腈-水(磷酸)、甲醇-水(冰醋酸)、甲醇-磷酸缓冲盐、甲醇-乙腈-甲酸等体系进行梯度洗脱试验,通过比较分离度、出峰时间、峰宽和峰的对称性等因素,最后确定为乙腈-水(冰乙酸)体系最合理。从供试品色谱图(图2)中可以看到,该色谱条件不仅可以测定1、3、4、5、9号峰对应GC、EGC、CAF、EGCG、ECG类成分,对2号峰C、6号峰EC和8号峰GCG同样可以测定,但由于这些成分在样品中含量较低,在此未作研究。3.3柱温的确定在试验时发现,使用表1的梯度洗脱程序,柱温对各组分的分离有一定影响,分别采用在20、30、40℃条件下,对碧螺春茶叶供试品溶液进行检测,结果发现,当20℃时,EGC峰和CAF峰以及EGCG峰和EC峰分离较差,整个色谱图出峰时间拖后,分离时间大约80min,当温度提至40℃时,色谱分离时间虽然缩短,柱效得到了明显提高,但温度过高可能会影响色谱柱的使用寿命,兼顾上述两原因,综合考虑,最后确定柱温为30℃。3.4样品前提取方法筛选曾以水、甲醇、乙醇3种溶剂为溶媒对茶叶进行提取试验,考虑到温度高于80℃,有部分的茶多酚类化合物发生氧化,因此试验条件均采用在80℃进行,采用回流、超声提取和80℃浸泡3种方法对茶叶的提取效果进行比较。液相检测结果表明,几种方法在峰数目及峰面积上差异很大,热水提取法,咖啡因和极性大的儿茶素类化合物提取率较高,而有部分的脂溶性儿茶素不能完全溶出;甲醇提取法,虽然提取完全,但提取液中出现大量的叶绿素,进行液相色谱检测时,泵压明显增大,对色谱柱污染严重,使柱寿命变短;乙醇提取法,兼顾了上述两溶剂