草鱼鱼糜凝胶形成过程中的化学和蛋白质构象变化

草鱼鱼糜凝胶形成过程中的化学和蛋白质构象变化

近年来，国内外研究科学家普遍认为，中国淡水养殖原料加工是发展水生养殖的重要方向之一。草鱼(Ctenopharyngodonidellus)是我国重要的淡水养殖鱼类,对草鱼鱼糜蛋白质结构与凝胶特性的研究可为其他淡水鱼鱼糜制品的研究提供一定的理论依据。凝胶特性是鱼糜制品最重要的功能特性。鱼糜制品的弹性是硬度、伸缩性以及黏度的综合体现,主要取决于鱼糜中蛋白质的凝胶情况。鱼糜中肌球蛋白的凝胶过程是影响鱼糜制品的关键,蛋白质构象的变化决定鱼糜凝胶特性。因此,研究鱼糜及蛋白质构象在凝胶形成过程中的变化和规律,对进一步阐明鱼糜蛋白质凝胶形成的机理,具有重要的意义,并可为生产优质鱼糜制品提供基础理论依据。国内外对鱼糜凝胶特性的研究比较多,但是对其凝胶形成机理的研究较少。天然肌肉蛋白的构象是通过氢键、二硫键、离子键、疏水键相互作用、范德华力等化学作用力来维持的。上述化学作用力在肌原纤维蛋白凝胶结构中发挥不同的作用。因此研究鱼糜凝胶形成过程中化学作用力的变化可为鱼糜凝胶形成机理奠定理论基础。激光拉曼光谱是研究蛋白质构象的重要手段。拉曼光谱不仅能得到有关氨基酸组成的信息,还能进一步得到某些二级结构如α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲方面的信息,对分子振动具有指纹式的分辨率,是研究鱼糜凝胶中蛋白质构象的一种较为有效的技术。因此,本研究拟在测定鱼糜凝胶过程当中化学作用力变化的基础上,用拉曼光谱技术测定凝胶过程中鱼糜蛋白质结构的变化,来研究化学作用力和蛋白质构象对鱼糜凝胶形成的影响。1材料和方法1.1试剂与仪器鲜活草鱼:于2010年4月购自上海南汇水产品市场。平均体质量(3500±150)g。尿素、β-巯基乙醇国药集团化学试剂有限公司;十二烷基磺酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷上海西宝生物科技有限公司;以上试剂均为分析纯。1.2仪器和测试方法SC-15数控超级恒温槽宁波新芝生物科技有限公司;HSS型电热恒温水槽重庆四达科技有限公司;EL204电子天平、FE20pH计MettlerToledo公司;涡旋混合仪上海沪西分析仪器厂;UV2100紫外分光光度计尤尼柯上海仪器有限公司;LabRam-1B型显微激光拉曼光谱仪法国JY公司。1.3方法1.3.1制备抗冻剂鲜活草鱼→去鳞、内脏、头、尾→清洗→采肉→斩碎→漂洗(4倍于鱼糜质量的清水,漂洗4次,水温不高于10℃)→挤压脱水→鱼糜→添加抗冻剂(4%山梨醇、4%蔗糖和0.3%多聚磷酸盐)→密封分装,-20℃冷藏备用1.3.2盐充鱼糜凝胶的制备已制备的冷冻鱼糜经自然解冻,空擂2min后加入质量分数2.5%食盐进行盐擂10min,灌入肠衣,于40℃加热60min后制得凝胶化鱼糜,再于90℃加热30min,流水下冷却制得鱼糜凝胶,储藏于4℃冰箱中备用。1.3.3化学力的测定参考Gómez-Guillén等的方法。1.3.4蛋白质含量参考Benjakul等的方法,略有改动。取1g鱼糜凝胶样品,加入20mL20mmol/LTris-HCl缓冲液[(含1g/100mLSDS,8mol/L尿素和体积分数2%β-巯基乙醇,pH8.0]并均质,混合物于100℃加热2min后,于室温搅拌4h,10000r/min离心30min。取上清液10mL,添加50g/100mL的冷三氯乙酸(TCA)至终质量分数为10g/100mL,混合液于4℃放置18h,10000r/min离心30min,沉淀物用10g/100mLTCA冲洗并溶解于0.5mol/LNaOH溶液中。总蛋白含量为凝胶直接溶解于0.5mol/LNaOH溶液中测得的蛋白质含量。蛋白质含量用Lowry法测定。溶解率表示为溶解于溶剂中的蛋白质占总蛋白含量的百分比。1.3.5多步拉伸m激光光源为氩离子激光器。激光波长514nm,功率为10mW,采集时间为10s,扫描次数为40次,分辨率约1.2cm-1,拉曼位移范围200~3999cm-1。2结果与分析2.1凝胶的形成机理维持蛋白质三维网络结构的作用力包括氢键、疏水相互作用、离子键和二硫键。由图1可知,新鲜制备的草鱼鱼糜经冻藏后,离子键和氢键显著下降,而疏水相互作用和二硫键增加。鱼肉蛋白在冻藏中,由于链的展开变性,原先位于分子内部的一些疏水性氨基酸暴露在蛋白质分子的表面,从而使蛋白质的表面疏水性发生变化。鱼糜中水分形成冰晶,肌原纤维蛋白空间结构发生改变,使埋藏在分子内部的巯基暴露出来,进而被氧化成二硫键,因此二硫键增多。二硫键也对经冷冻储藏鱼糜凝胶的形成及其强度起着非常重要的作用。在肌肉蛋白质中,巯基影响三磷酸腺苷(ATP)酶的活性,参与肌肉收缩。在鱼糜的凝胶形成过程当中,离子键、氢键呈下降趋势,疏水相互作用和二硫键呈现上升趋势。阴阳离子通过静电相互作用形成的离子键通常在蛋白质聚集过程当中表现为相互排斥力,特别是在体系中仅含有一种蛋白质或含有相似等电点(pI)的不同种蛋白质的情况下。处于等电点时蛋白质的静电荷为零,当环境的pH值接近pI时,蛋白质分子快速随机的聚集,易形成凝结块。当体系pH值处于pI和极端pH值的中间区域时,静电排斥力和疏水相互作用很好的平衡,从而形成凝胶网络。鱼糜受热时包埋的非极性多肽暴露出来,从而增强了邻近多肽非极性片段的疏水相互作用。因而疏水性影响凝胶的形成过程。2.2sds-尿素和-基乙醇对鱼糜凝胶的化学键作用鱼糜凝胶溶解率的高低可以反应形成非二硫共价键的多少。内源性转谷氨酰胺酶(TGase)普遍存在于鱼体中,可催化肌球蛋白重链交联形成非二硫共价键。而含SDS、尿素和β-巯基乙醇的混合溶剂能够断裂鱼糜凝胶中除了非二硫共价键外所有化学键。由图2可知,凝胶化鱼糜与鱼糜凝胶的溶解率具有不同程度的降低,说明凝胶形成过程中形成了非二硫共价键。由此可知,非二硫共价键也是参与鱼糜凝胶网络结构形成的主要作用力之一。2.3凝胶化鱼糜凝胶的-螺旋结构和二硫键在鱼糜凝胶形成过程当中,蛋白质的拉曼光谱变化如图3、4所示。拉曼(Raman)光谱是研究物质结构的重要手段之一,拉曼散射是光散射现象的一种。单色光束的光子与分子相互作用时可发生弹性碰撞和非弹性碰撞。在非弹性碰撞过程中,光子与分子之间发生能量交换,从而改变光子的频率。拉曼光谱是研究分子振动和转动的分子光谱。任何物质都有确定的分子结构,也都有自己独特的拉曼光谱。生物大分子的拉曼光谱可得到许多结构方面的信息。蛋白质沿主链的肽基团—C(O)—N(H)—可能与远侧的,也可能与邻近的肽基团—C(O)—N(N)—形成氢键。侧链相互作用和主链氢键形成的结果,使多肽和蛋白质有确定的二级结构,如α-螺旋、平行或反平行的β-折叠结构、γ-转折和无规卷曲。在酰胺基团的振动中,酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ的拉曼光谱峰对蛋白质主链构象的变化有着最为显著的敏感性。在α-螺旋蛋白质结构中,这两个峰值通常可在1645~1655cm-1和1260~1300cm-1范围内找到。前者主要来源于C=O伸缩模,同时也有CN伸缩模的少量贡献。当从α-螺旋形式向β-折叠转变时,这两个峰分别偏移向1665~1680cm-1和1230~1245cm-1范围。如若蛋白质是不规则的或无序形式,则酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ峰将出现在1655~1665cm-1和1245~1270cm-1范围。由图3可知,鱼糜和凝胶化鱼糜在AmideⅠ区域谱带,鱼糜蛋白出现在1651cm-1和1654cm-1,表明主要存在α-螺旋结构,而鱼糜凝胶在1657cm-1出现无规则卷曲特征谱带,表明鱼糜蛋白的α-螺旋结构变成了无规则卷曲。酰胺Ⅲ区中,鱼糜蛋白在1265cm-1出现α-螺旋特征峰,凝胶化鱼糜和鱼糜凝胶除了保持α-螺旋的特征谱带外,还在1267cm-1分别出现了反应无规则卷曲的特征峰,进一步说明凝胶过程中鱼糜蛋白的α-螺旋结构转变为无规则卷曲。在凝胶形成过程中未见β-折叠的特征谱带出现。以上分析表明,鱼糜凝胶的形成过程当中,蛋白质二级结构的变化主要表现在α-螺旋变为无规卷曲结构,从而有益于蛋白质分子间的聚集和相互作用。拉曼光谱中,二硫键是CC—SS—CC中的S—S键,它的伸缩振动频率是C—S键和C—C键的内旋转的函数,二硫键对其所处的环境十分敏感。480~550cm-1,是蛋白质和多肽S—S键的伸缩振动模式。将位于500~510cm-1处归属为扭式-扭式-扭式(g-g-g)模式,515~525cm-1处归属为扭式-扭式-反式(g-g-t)模式,535~545cm-1处归属为反式-扭式-反式(t-g-t)模式。由图3可知,鱼糜中二硫键特征谱带很弱,凝胶后增强,表明凝胶化过程中形成了二硫键。与凝胶过程中化学作用力的变化分析结果一致。830cm-1和850cm-1附近的费米共振双峰为肌球蛋白侧链酪氨酸残基的谱图,双峰反映的是酪氨酸对羟苯基环的振动,其受环境和氢键中酚羟基的影响。峰强度比值I850cm-1/I830cm-1可判明酪氨酸在蛋白质分子中所处的状态。当两者的强度比≥1时,说明酪氨酸残基在肌球蛋白分子表面暴露的程度相对比较大,易通过氢键和溶剂水分子发生相互作用;当两者的强度比小于0.3时,酪氨酸残基在肌球蛋白分子表面暴露的程度增加,也易于与水分子形成氢键;而当两者强度比在0.7~1.0时,则可认为酪氨酸残基包埋在肌球蛋白分子内部。由图3可知,生鱼糜在830cm-1和850cm-1附近现酪氨酸残基的双峰,强度比为0.98,说明酪氨酸残基位于分子内部;经凝胶化后,双峰出现在838cm-1和859cm-1附近,强度比为1.04,表明凝胶化后酪氨酸残基暴露于分子表面。此变化表明,凝胶形成过程中,α-螺旋解旋,蛋白质伸展导致鱼糜蛋白疏水相互作用增强。1424cm-1是赖氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸的特征频率;1402cm-1是天门冬氨酸和谷氨酸COO—的振动频率。2500~3200cm-1附近的图谱主要来自芳香族和芳香族残基的C—H伸缩振动。由图4可知,三者C—H伸缩振动均出现在2932cm-1处,显示饱和脂肪族的特征。由以上分析可知,凝胶形成过程当中,鱼糜蛋白的α-螺旋部分转变为无规卷曲,将引起维持蛋白质α-螺旋结构的主要化学作用力氢键的断裂,蛋白质伸展,使之在凝胶形成过程中氢键减少,同时疏水基团暴露,使疏水相互作用增强。巯基在加热过程中被氧化成二硫键。3讨论3.1凝胶形成过程主要影响到离子键和氢键在鱼糜的凝胶形成过程中,离子键、氢键呈下降趋势,疏水相互作用和二硫键在凝胶化阶段呈现上升趋势。以往有学者认为离子键和氢键是凝胶形成和维持凝胶网络结构的重要作用力。但本实验结果表明,在凝胶形成过程当中,离子键和氢键显著下降。由此可见,离子键和氢键不是维持鱼糜凝胶稳定结构的主要化学作用力。鱼糜受热时包埋的非极性多肽暴露出来,从而增强了邻近多肽非极性片段的疏水相互作用。因而疏水性应该影响凝胶的形成过程。二硫键也对经冷冻储藏鱼糜凝胶的形成及其强度起着非