马铃薯田早死病病原菌的分离与鉴定

马铃薯田早死病病原菌的分离与鉴定

作为重要的食品、蔬菜、饲料和轻化剂原料，马蹄在中国有着很大的种植面积。甘肃省年种植马铃薯面积达65万hm2,约占全国的1/9,居全国第3位;定西市年种植马铃薯近23.3万hm2,占甘肃省种植面积的1/3。由于马铃薯具有产量高、适应性强、经济效益显著等特点,定西市从1997年实施“洋芋工程”以来,种植面积一度猛增,进入2000年以来,种植面积稳定在23.3万hm2左右,迎、重茬现象非常普遍,导致目前病害发生种类多,发病重。2009-2010年在全市各县区调查中发现一种新的病害,造成马铃薯在田间早死,对马铃薯的产量造成较大损失。为了提供科学的防治依据,对早死病株进行了病原真菌的分离与鉴定。鉴定结果显示,该病由球炭疽菌(Colletotrichumcoccodes)引起。2007年刘会梅等对马铃薯炭疽病研究进展进行了相关报道;2011年张建成等在宁波进境船舶携带薯块上分离并鉴定了该病原菌;同年王丽丽等将该病报道为新疆乌昌地区5种新纪录之一。1材料和方法1.1样本的来源和症状描述标本来源于甘肃省定西市安定区团结镇上杨家川村一‘克新1号’地膜马铃薯田早死病株。通过田间自然感病和人工接种发病植株进行症状描述。1.2马铃薯生长与土壤的制备选取马铃薯地下茎秆有黑色菌核的病健结合部,切取0.5cm小块,表面用75%乙醇消毒3min,无菌水冲洗3次,置于PDA培养基上25℃培养,待长出菌丝后,挑取菌落边缘进行纯化,纯化后的菌落通过单孢分离培养。按每1kg灭菌土壤接18g含有大量黑色菌核的培养基,混匀、装入直径15cm的花盆中,未混合菌种的灭菌土壤作对照。将马铃薯‘克新1号’每盆种植一株,并作详细记载。依据柯赫氏法则确定病原菌。1.3社会学的评价观察病原菌在PDA平板上的菌落特征、产孢情况,并对分生孢子盘、刚毛、分生孢子长宽进行显微测量。1.4生物鉴定病原菌的分子生物学鉴定委托上海基康生物技术有限公司完成。1.4.1提取的dna病原菌DNA提取采用易润华等的方法。1.4.2pcr产物的纯化采用真菌核糖体基因ITS区域引物D1(GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG)和D2(GGTCCGTGTTTCAAGACGG)扩增ITSrDNA。反应在20μL体系中进行,体系含有2×SuperTaqMix10μL,primerF1μL,primerR1μL,DNA模板1μL,ddH2O7μL。反应程序为:94℃预变性2min,进入循环,94℃变性20s,50℃退火10s,72℃复性30s,35个循环,最后72℃延伸2min,4℃保存。取5μL反应产物于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,在紫外投射仪下检测PCR产物大小,DNAMarkerDL2000。用北京博大泰克生物工程有限公司的PCR产物纯化试剂盒;扩增产物上样ABI3730DNA测序仪检测,采用双脱氧测序法,测序引物为D1/D2,进行双向测序。1.4.3同源序列搜索使用BioEdit校对测序结果并拼接序列。测序后的序列经校正后,在核酸序列数据库GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nihgov/)中进行同源序列搜索,比较测试菌株与数据库中相应序列的相似程度。2结果与分析2.1地表下主茎组菌核数量根、地下茎和匍匐茎都产生大量黑色菌核、大小0.5mm,尤其地表下主茎基部空腔内菌核数量最多。田间越冬病株残体皮层组织脱落,呈现“纤维状”,表皮生大量菌核。2.2疾病的测量接菌植株地表以下主茎表现出与自然病株相同的症状,未接菌植株表现正常。从回接发病马铃薯植株上100%分离得到原接种病菌。2.3浓度lm法病菌在PDA培养基上菌丝乳白色表生,产生大量菌核,呈同心环状排列。分生孢子盘聚生于菌核上,黑褐色,直径220～320μm,刚毛聚生或散生于分生孢子盘中,褐色至暗褐色,刚硬,至上端渐细,(50.9～174.6)μm×(2.4～4.8)μm,平均100.3μm×4.2μm,有1～3个隔膜。分生孢子直或纺锤形、上尖下圆、无色,单胞、有的中腰缢束,(15.07～24.66)μm×(2.58～4.45)μm,平均20.32μm×3.63μm。2.4p左右条带使用真菌ITS区域的引物D1和D2扩增出了600bp左右的条带(见图2)。将扩增产物测序所得序列与GenBank中核酸数据进行Blast分析,该序列与已报道的C.coccodes序列同源性最高,相似性达97%。3马铃薯炭疽病马铃薯炭疽病是马铃薯生产上的一种毁灭性病害,可以侵染马铃薯的各个生长部位,尤其对生长期地下主茎危害严重,引起马铃薯早死。根据2010年生长期调查,定西市安定区团结镇地膜马铃薯‘克新1号’植株7月中旬开始发病,7月底全部枯死,比正常植株提前枯死2个多月,经测产减产28%,对产量影响十分严重。这与Tsror等研究表明能够减产22%～30%相符合。该病是由球炭疽菌引起的,在田间土壤中可以自由存活长达13年,同时可以侵染葫芦科、茄科、胡椒科等13个科的35种寄主,尤其喜欢马铃薯、番茄、胡椒等。马铃薯炭疽病分布于50多个国家。在我国吉林、山东、浙江、新疆已有报道。该病一旦扩散传播,对我省马铃薯产业将会造成不可估计的损失。NadavNitzan等研究表明通过接菌此病可以侵染多种作物和杂草,国外主要采用轮作栽