表没食子儿茶素没食子酸酯与猪胰脂肪酶相互作用的荧光光谱研究

表没食子儿茶素没食子酸酯与猪胰脂肪酶相互作用的荧光光谱研究

近年来，肥胖已成为一种常见的健康问题，与人类脂肪酶的活性密切相关。在食物的消化吸收过程中,人体所摄入的大部分脂肪在脂肪酶的作用下被降解,然后在小肠被吸收利用。因此,能有效控制脂肪酶的活性,便可减少食物中脂肪的消化吸收,从而控制肥胖。人们通过饮茶摄入一定量儿茶素类物质能在消化道中与胰脂肪酶(PPL)发生作用,通过抑制酶的活性来减少脂肪吸收。通过饮茶预防肥胖在民间已有广泛的认识,但目前缺乏基于食品化学的基础研究。因此,本实验以表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)为分子探针,采用荧光光谱及分子对接法研究EGCG与PPL的相互作用,为该类天然产物在减肥食品中的应用及其他相关研究提供一定的参考。1材料和方法1.1材料和试剂EGCG四川碧馥生物科技有限公司;猪胰脂肪酶德国Ruibio公司;橄榄油国药集团化学试剂有限公司;苯、吡啶、醋酸铜等均为分析纯。1.2u3000仪器F-4000荧光光谱仪日本日立公司;2501PC紫外分光光度仪日本岛津公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器河南省予华仪器有限公司;GL-20G-C高速离心机上海安亭科学仪器厂;DiscoveryStudio3.1程序美国Accelrys公司。1.3方法1.3.1金属离子的影响PPL、EGCG和金属离子溶液均用0.05mol/L的TrisHCl缓冲液(pH7.7)配制。取3mL质量浓度为0.5mg/mL的PPL溶液与0.3mLEGCG溶液于1cm荧光比色皿中混匀(EGCG最终浓度为0×10-5、0.8×10-5、1.6×10-5、2.4×10-5、3.2×10-5、4.0×10-5、4.8×10-5、8.0×10-5、9.6×10-5mol/L),在不同温度(20、30、37℃)条件下静置5min后测试。荧光激发波长280nm,入射和出射狭缝5nm,荧光发射扫描范围290~450nm。在研究金属离子对EGCG-PPL相互作用及荧光特性的影响时,实验条件同上。于EGCG-PPL混合溶液中分别加入0.3mL浓度为4×10-4mol/L的CaCl2、MgCl2、CuCl2、FeCl2溶液,摇匀,37℃温度条件下静置5min后分析。1.3.2活性物质检测采用改进的分光光度法测定EGCG对PPL的半抑制浓度(IC50)。PPL、EGCG和金属离子溶液配制方法同上。取4mLTris-HCl缓冲液和2mL橄榄油于50mL锥形瓶中,37℃水浴5min后,依次加入1mL4×10-4mol/L金属离子溶液、1mL质量浓度分别为0、0.5、0.8、1、1.5、2mg/mLEGCG溶液、1mL2mg/mL酶液。37℃温度条件下恒温磁力搅拌5min后加入10mL苯,搅拌混匀后离心,取上层有机相8mL于小锥形瓶中,加入2mL显色剂(5%醋酸铜,吡啶调节至pH6.1),搅拌混匀后离心,于710nm波长处测定上层液吸光度。以空白溶液为参比,计算EGCG对PPL的抑制率,并基于EGCG质量浓度与抑制率的回归方程计算IC50,分析不同金属离子对IC50的影响。1.3.3受体猪胰脂肪酶-氧化酶-三乙二醇甲醚三联体晶体结构采用DiscoveryStudio3.1程序进行分子对接。配体EGCG晶体结构由Zinc数据库(/)提供,能量优化后使用。受体猪胰脂肪酶-辅酶-三乙二醇甲醚三联体晶体结构(蛋白质编码:1ETH,分辨率2.8Å)。通过“FindSitesfromReceptorCavities”模块寻找EGCG-PPL结合位点,以最佳位点作为活性位点,设定活性球半径10Å,通过CDOCKER进行分子对接。2结果与分析2.1ecgg与ppl相互作用的荧光分析2.1.1蛋白质结构变化分析微环境蛋白质的荧光性主要源于分子中色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸的苯环和共轭双键结构,其荧光特性与基团的空间结构及环境密切相关,因此,其可被作为荧光探针分析蛋白质结构的变化及微环境信息。EGCG在实验条件下无荧光。由图1可知,EGCG与PPL之间存在明显的相互作用,随EGCG质量浓度增大,PPL的荧光强度逐渐减小,最大荧光发射峰出现红移,这可能是由于EGCG与PPL作用,酶肽链伸展,使得部分荧光性氨基酸残基的空间结构发生改变。2.1.2ecgg对ppl的荧光创造荧光猝灭通常分为动态和静态过程。动态猝灭中猝灭剂通过碰撞荧光物质使其返回基态,不再发射光子,而静态过程中猝灭剂与荧光物质结合,生成不发射光子的基态复合物。动态猝灭过程遵循Stern-Volmer方程:式中:F0和F分别为加入猝灭剂前后荧光分子的荧光强度;Kq为猝灭常数(该值越大猝灭效应越明显);τ0为荧光分子的初始平均寿命(生物大分子约为10-8s);c为EGCG浓度/(mol/L)。以F0/F对c作图(图2),可知不同温度条件下EGCG对PPL的荧光影响。c小于3.2×10-5mol/L时,F0/F与c具有良好的线性关系。如基于直线斜率及Stern-Volmer方程可知20、30、37℃条件下EGCG对PPL的猝灭常数Kq分别为2.749×1012、2.346×1012、1.833×1012L/(mol·s)。文献[12-14]表明各类猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭常数为2×1010L/(mol·s),而本实验所得Kq远高于由碰撞引起的猝灭效应,这表明在低浓度时,EGCG对PPL的荧光猝灭不是由碰撞造成的,而是由于静态猝灭,即EGCG与PPL结合生成了不发射光子的基态复合物。随着EGCG浓度增大,F0/F-c曲线向上弯曲,这表明猝灭剂同时产生了静态和动态猝灭效应。这可能是在静态猝灭的同时,高质量浓度的EGCG亦可与PPL发生非结合碰撞,从而引起部分动态猝灭效应。2.1.3ppl与egg的相互作用静态猝灭中猝灭剂与荧光物质的结合常数(Ka)与结合位点数(n)符合方程:式中:F0、F和c意义与方程(1)相同。如前所述,EGCG能与PPL作用生成不发射光子的基态复合物,从而引起PPL静态猝灭。以lg[(F0-F)/F]对lgc作图,由拟合直线的斜率和截距即可求得结合位点及结合常数,其结果列于表1。由此可知,EGCG与PPL的结合常数达104数量级,并形成一个结合位点,在20℃温度条件下二者即能形成较强作用,温度升高能增强EGCG与PPL作用,但对其结合常数和作用位点影响不大。2.1.4温升结合常数抑制剂与酶之间的作用包括氢键、疏水作用、范德华力和静电作用等,根据其熵变(ΔS)和焓变(ΔH)可以推断二者的主要作用方式。根据公式(3)~(5)可计算EGCG与PPL相互作用的热力学参数,结果见表2。式中:ΔG、ΔH和ΔS分别为吉布斯自由能、焓变和熵变;R是气体常数;(Ka)1和(Ka)2分别是温度T1和T2条件下的结合常数。计算发现在不同温度条件下反应的ΔH值相近,研究中取其均值作为后续计算的依据。如表2所示,ΔH>0,说明EGCG与PPL的结合反应是吸热过程,升温有利于反应进行,结合常数Ka将变大,这与表1结果一致。ΔG<0,说明EGCG与PPL的结合反应是一个自发的过程。焓变ΔH>0,熵变ΔS>0,可以推知EGCG与PPL的结合应主要源于疏水作用。由于ΔH<TΔS,可以认为焓效应对ΔG的贡献相对较小,因此EGCG与PPL的相互作用主要是熵增所驱动的。大分子弱相互作用中,多种因素会影响其荧光特性。文献[12-14]表明升温将降低静态荧光猝灭效应,这与观测结果一致(图2)。基于上述计算可知,升温增加了EGCG与PPL的结合常数,可促进二者生成不发射光子的基态复合物,但同时高温也会加剧该基态复合物的自由运动和相互碰撞,降低其稳定性,从而减弱荧光猝灭效应,因此实验中观测到EGCG对PPL的荧光猝灭应源于多因素作用结果。2.2fe2+离子对ecgg与ppl的结合特性及对酶活的影响研究发现,EGCG与PPL结合后,酶活受到一定的抑制作用,在37℃温度条件下EGCG的半抑制质量浓度为0.25g/L。实验中基于荧光和酶活分析,进一步研究了在Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+离子存在条件下EGCG与PPL的结合特性及对酶活的影响。从表3可知,几种离子对EGCG与PPL的结合产生了不同影响,Ca2+、Mg2+减小了二者的结合强度,而Cu2+、Fe2+对其结合具有促进作用,但4种金属离子均增大了EGCG对PPL的半抑制质量浓度,表明它们能减弱EGCG对PPL活性的抑制。金属离子对酶活的影响是酶化学研究中的一个重要领域,它们可以通过改变酶的微环境及改变抑制剂与酶的结合等多种方式来影响酶的催化特性。因此,Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+能减弱EGCG对PPL的酶活抑制,这应源于多种影响的综合作用,其具体机理还有待进一步研究。2.3ecgg与ppl的相互作用PPL多肽链折叠后在N末端活性部位有一疏水通道,从催化中心贯通到分子表面,可结合长链脂肪酸,并催化其降解。EGCG分子中含有多个苯环结构,具有一定的疏水性。基于荧光分析结果,EGCG与PPL仅有一个作用位点,所以EGCG可能结合于PPL肽链折叠后形成的疏水通道中。实际上,从图3分子对接得到的最佳构象可以看出,EGCG结合于PPL分子中由PHE78、ILE79、TRP86、LEU154、ALA179、PRO181、PHE216、TRP253、VAL260、ALA261、LEU265等氨基酸形成的疏水腔内,说明EGCG与PPL的主要结合力为疏水作用,这与热力学计算结果一致。图3b表明,EGCG可与结合位点周围的氨基酸ASP80、TYR115、HIS152、SER153、ARG257形成氢键,此外,EGCG分子的苯环还能通过Pi-Pi堆叠与PPL分子中的含芳香环氨基酸(如TYR115)发生作用。上述结果表明,EGCG与PPL之间除了疏水作用外,氢键与Pi-Pi堆叠也能促进二者的相互作用。EGCG与PPL的相互作用可使PPL肽链伸展,并引起PPL荧光猝灭。分子对接研究表明,在二者作用中,EGCG与肽链中多个荧光性氨基酸相距很近(如TRP86、TYR115、TYR268),可导致这些基团暴露在疏水环境中,从而引起PPL荧光发射峰红移。不同脂肪酶的活性中心通常是由丝氨酸(Ser)和组氨酸(His)组成,并与另一氨基酸残基(天冬氨酸或谷氨酸)一起组成一个三元催化中心。EGCG与PPL活性中心基团SER153、ASP177、HIS264相距较近,并能与SER153形成