第五章分子发光分析课件

第五章 分子发光分析molecular luminescence

analysis1目前，该分析方法广泛应用于生命物质（DNA、蛋白质、糖类）的检测，病毒、细胞等活性物质的分析，超痕量元素分析等！DNA排序SAR病毒、禽流感病毒的检测单分子检测2目

录3第一节

概

述第二节 分子荧光分析法第三节 分子磷光分析法第四节 化学发光分析法第一节

概

述一、分子发光的定义基态分子受到能量激发，吸收了一定能量后，跃迁至激发态，激发态分子在很短时间内以辐射跃迁（发光）形式释放能量并返回基态，便产生了分子发光。激发态外部能量4光辐射基态外部能量5光辐射基态根据激发方式不同，分子发光可分为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光等。其中，光致发光根据激发态不同可分为荧光和磷光两种。激发态第一节

概

述第二节 分子荧光分析法6Molecular

Fluorescence

Analysis掌握要点：分子荧光分析法的定义、发展和特点；分子荧光的产生，荧光光谱及相关知识；如何用分子荧光分析法进行定量测定；荧光分析仪器；荧光分析法的应用。某些物质被紫外光照射激发到单重激发态后，在回到基态的过程中发射出比原激发波长更长的荧光，通过测量荧光强度进行定量分析的方法。一.分子荧光分析法的定义紫外光7荧光基态单重激发态二.分子荧光分析法的特点8灵敏度较紫外可见分析法高2－4个数量级；选择性较好；主要用于定量分析；能发射荧光的物质较少，应用不如紫外可见广泛。其高灵敏度和许多生命物质都具有荧光性质，所以该方法在药物、临床、环境、食品的微量和痕量分析以及生命科学研究上具有重

要意义。三.分子荧光分析法的发展第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为

“LignumNephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。在17世纪，Boyle（1626—1691）和Newton（1624—1727）等著名科学家再次观察到荧光现象。91852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光。他还由发荧光的矿物

“萤石”推演而提出“荧光”这一术语.入射光荧光10Stokes还对荧光强度与浓度之间的关系进行了研究，描述了在高浓度时以及外来物质存在时的荧光猝灭现象。此外，他还是第一个（1864年）提出应用荧光作为分析手段的人。1867年，Goppelsr进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。1880年，Liebeman提出了最早的关于荧光与化学结构关系的经验法则。到19世纪末，人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等600种以上的荧光化合物。1119世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台光电荧光计。早期的光电荧光计的灵敏度是有限的，1939年Zworykin和Rajchman发明光电倍增管以后，在增加灵敏度和容许使用分辨率更高的单色器等方面，是一个非常重要的阶段。1943年Dutton和Bailey提出了一种荧光光谱的手工校正步骤，1948年由Studer推出了第一台自动光谱校正装置，到1952年才出现商品化的校正光谱仪器。12荧光分析方法的发展，与仪器的发展是分不开的。目前，荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观和自动化的方向发展，方法的灵敏度、准确度和选择性日益提高，方法的应用范围大大扩展，遍及于工业、农业、医药卫生、环境保护、公安情报和科学研究等各个领域中。13四.分子荧光的原理

分子轨道的多重态分子多重态M定义为M=2S+1如果分子中的电子自旋方向相反的，此时S=0，M=l，这种态被称为单重态或S态。一般分子的基态是单重态S0，若被激发时自旋方向没有改变，则得到激发单重态S1、S2；如果被激发的电子在激发时自旋方向发生了改变，呈(↑↑)或(↓↓)，则S=1，M=3，此种态被成为三重态或T

态。14电子跃迁态图解图中按能量的高低，将单重态与三重态分别以S0、S1、S2…和T1、T2…表示之。应该指出，三重态的能量总是低于相应的单重态的。电子的跃迁需受“选择律”的限制

，S0→T1

禁阻跃迁（几率很小）。15荧光的产生人们16世纪就发现荧光现象，但真正懂得解释这一现象的时候，时间已经过了300多年了……首先，人们懂得在分子的角度上解释。对紫外光或可见光产生选择性的吸收。电子跃迁到激发态.具有不饱和键的基态分子.电子跃迁到激发态后，不稳定，要跃迁回基态，在这过程中能量需要被释放，通过发光的形式和其他形式，我们称为辐射跃迁和非辐射跃迁。16S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量λ

2λ

1λ

3外转换λ

′2T2内转换振动弛豫17

电子跃迁类型电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；18传递途径辐射跃迁荧光 磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10

-9

s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；非辐射能量传递过程19振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10

-12

s。内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。辐射能量传递过程光照停止后，可持续一段时间。20荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长为λ

‘的荧光；10-7～10

-9

s

。2由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；λ

‘>λ2

2>λ

1；磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1

→S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（

S0

→T1禁阻跃迁）S0

→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1发光速度很慢：10-4～100

s

。波长跟激发态－基态能量差有关，强度与发生跃迁分子多少有关。21

荧光和磷光光谱五.激发光谱与荧光(磷光)光谱波长

的关系曲线荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？1.荧光(磷光)的激发光谱曲线固定测量波长(

选最大发射波长),

化合物发射的

荧光

( 磷光

) 强度

与

照射光（图中曲线I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；222.荧光光谱(或磷光光谱)固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。2324波长（nm）丁省的激发光谱和荧光发射光谱2526五.荧光效率和影响因素1.分子产生荧光必须具备的条件具有合适的结构；具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（φ）：荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；272.化合物的结构与荧光跃迁类型：π*→π的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。28293.影响荧光强度的因素30影响荧光强度的外部因素：溶剂的影响除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加；溶液pH对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；4.内滤光作用和自吸现象内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。315.溶液荧光的猝灭32碰撞猝灭；氧的熄灭作用等。一、定量依据荧光量子产率（φ）：当被测物浓度很小时，A<0.05，

If=

2.3φI0A

＝2.3φI0kbC其中，If为荧光强度，Ia为被吸收的激发光强度。I0为入射光强度，I为透射光强度。＝IfIa＝IfI0-I因为I0A=lg——I则I=I0×10-AIf=

φ

(I0-I)=

φI0(1-10-A)=

φI0[2.3A--

-…](-2.3A)2(-2.3A)32!

3!五.荧光定量分析法33If=

2.3φI0kbC＝KC标准曲线法测定34二、仪器流程测量荧光的仪器主要由五个部分组成：激发光源、第一单色器、样品池、第二单色器、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：光源：氙灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；检测器：光电倍增管。3536三、荧光法的应用1.单组分物质的直接测定和间接测定无机离子如Mg、Al、Ca等，本身不发射荧光，但与有机试剂可形成荧光配合物进行定量测定；有机化合物本身发射荧光的，如罗丹明B、荧光素等可直接测定；不发射荧光的物质可经过处理后成为发射荧光的物质进行测定；生命物质大部分的酶、蛋白质、维生素等可发射荧光。37激发光波荧光波待测物试剂长nm长nm测定范围c

/（μg/ml）丙三醇苯胺紫外蓝色0.1～2糠醛蒽酮4655051.5～15蒽3654000～5苯基水杨酸N,N'二甲基甲酰胺3664103×10-8～（KOH）5×10-6mol·dm-31-萘酚四氧嘧啶0.1mol·dm－3NaOH苯二胺紫外36550048510-10维生素A无水乙醇3454900～20氨基酸氧化酶等3154250.01～50蛋白质曙红丫紫外5400.06～6肾上腺素乙二胺4205250.001～0.02胍基丁胺邻苯二醛3654700.05～5玻璃酸酶3-乙酰氧基吲哚3954700.001～0.033青霉素α－甲氧基－6－氯－9-4205000.0625～0.625（

β－氨乙基）－氨基氮杂蒽382.其他应用