感受态细胞的制备

本文格式为Word版，下载可任意编辑——感受态细胞的制备一、电转化感受态细胞的制备

1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10mlLB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照）

2.37℃，220rpm，培养14-16个小时。

3.其次天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000mlLB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，中止培养。4.将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。

5.弃上清，离心杯中参与少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm离心10分钟。

6.弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。7.弃上清，往离心杯中参与少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油,4℃,4000rpm,离心10min。

8.弃上清，每个离心杯中参与5ml10%的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80℃冰箱中保存。同时取100μl感受态加0.01ngpuc18直接电穿孔转化，检测转化效率。

9.次日观测转化子生长状况，并记录。二、连接产物纯化

1．将连接产物转移至一1.5mlEppendorf管中，参与以下试剂:10μlofddH2O

2μlof3MNaAC（PH5.2）

50μlof无水乙醇

轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上；2.4℃，topSpeed离心30分钟；

3.防备移去上清，避免接触到管底的沉淀物；

4.参与500μl70%的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）；5.4℃，topSpeed离心5分钟；

6.防备移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味；7.参与10μlddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃长期保存备用；三、电转化

1.从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；

2.取1μl纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。3.将40～100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml的离心管中，防备混匀，冰上放置10min。

4.开启电转仪，调至Manual，调理电压为2.1KV。

5.将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；6.将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速参与1000μl的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。7．37℃，220－250rpm复苏1小时。

8.取20μl转化产物加160μlSOC涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。其余菌液加1：1的30%的甘油后混匀－80℃保存。

注：每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal80μl，SOC80μl，IPTG20μl。四、电击杯清洗流程1.用清水将电击杯稍冲一下。

2.向电击杯中参与的75%酒精浸泡2hr。

3.弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。

4.参与无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30分钟。5.弃去无水乙醇，于通风厨内挥干乙醇。6.将清洗好的电击杯放入-20℃冰箱内待用。注：1．不同样品使用的电机杯应分开；2．每周用1%酒精浸泡30分钟。

各位虫友好，想请教下大肠杆菌电转化方面的一些问题，希望各位虫友多多指教.最近一直在做电转化，可每次制备的电转化感受态细胞都不行，最开始做的还可以达到10的六次方，可最近两次做的，貌似做好的电转化感受态细胞里面的菌体全都死了？是为什么呢？有人有遇到这种状况的吗？还望各位网友多多指教，感谢不尽哈！急急急！！！chenchuan24891(站内联系TA)你应当自己好好去按文献的方法检查一下，大多数状况下是自己的失误造成的。假使还是这样的话，请你把你做的步骤给大家看一下。clx@6016(站内联系TA)1楼:Originallypostedbyclx@6016at2023-11-211134:

各位虫友好，想请教下大肠杆菌电转化方面的一些问题，希望各位虫友多多指教.最近一直在做电转化，可每次制备的电转化感受态细胞都不行，最开始做的还可以达到10的六次方，可最近两次做的，貌似做好的电转化感受态...先把新鲜划好的菌接到含有Amp的3mlSOB试管中，30度过夜培养，其次天以1:50的接种量转接到50ml含有Amp的SOB中(转接之前参与MgCl2)，30度摇菌2小时，OD600为0.1左右，然后参与L-阿拉伯糖诱导35分钟，OD600为0.3-0.4左右。5000转，4度离心10分钟，收菌。然后用10%甘油重悬3次，5000转，4度离心10分钟。最终将菌体浓缩500到800倍后保存在10%甘油中。然后立刻电转！假使有什么问题，还请各位前辈多多指教哈！

clx@6016(站内联系TA)3楼:Originallypostedbychenchuan24891at2023-11-270956:

你应当自己好好去按文献的方法检查一下，大多数状况下是自己的失误造成的。假使还是这样的话，请你把你做的步骤给大家看一下。恩，感谢哈！dnaxxx(站内联系TA)电转的话应当依照电转仪的说明来制备感受态吧，我们买的仪器有好多菌的protocol和建议电转条件

大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备

发布时间：2023年03月07日点击次数：：次

3.大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备

电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA在电场力的

作用下进入细胞，随后细胞复苏和弥合，从而实现质粒DNA的物理转移。为避免电击时出现“击穿〞，即产生电流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010转化子/μgDNA。

3.1．感受态细胞的制备

（1）感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备一致。（2）选适合的大肠杆菌在4℃，3000rpm下离心10min，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存1～2天）。

（3）弃上清，离心管中参与少量ddH2O，轻柔的悬浮沉淀后，再将水注满离心杯，4℃，3000rpm离心10min。（4）重复步骤（3）1次。

（5）防备弃上清（沉淀可能会很松散），再往离心管中参与少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油，4℃，4000rpm离心10min。

（6）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2～3ml，将细胞按200μl等份装入微量离心管，放置于－80℃下保存。

（7）依照钙转化感受态细胞方法进行转化效率和抗性检测。

3.2．电转化

为了降低离子浓度，待转化的质粒DNA，如质粒或酶连产物，在电转化前应当进行纯化（乙醇沉淀），以下所有步骤都需要保持无菌操作。（1）从－80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；参与待转化的质粒DNA，冰浴10min；同时将电转化杯进行冰浴。实际操作中，假使电转化杯浸泡在乙醇中，可提前取出电转化杯，在无菌的超净台上吹干。

（2）开启电转仪，调至Manual，调理电压为2.1KV。特别注意，不