8磷酸化修饰分析结题报告

目 项目主要结 工作流 SDS电 基于TrpleTOF5600的LC-ESI-MSMS分 标准生物信息分 Mascot搜 Pathway代谢通路注 文件下 附 SamplePhospho-IdentifiedIdentifiedIdentified222“Phospho-stes”为识别的磷酸化位点的总数；“IdentfedPhospho_S”为识别的丝氨酸位点数；“IdentfedPhospho_T”为识别的苏氨酸位点数；“IdentfedPhospho_Y”为识别的酪氨酸位点数。LB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT40.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT401.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT402.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT5.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT51.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT53.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/ATCK.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/CK1.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/CK3.phosphoryated_pro.xsPhospho-90%-75%-50%-010100表注：“Phospho-se”90%100%、75%90%、50%75%、50%为鉴定到的位点实际发生磷酸化的可能性区间；第三列至第六列为每一个可能性区间相应的磷酸化位点数。Total000010表注：“oa_Num”为可能性大于75%的磷酸化位点的个数；“p_num“为丝氨酸发生磷酸化的个数；p_num发生磷酸化的个数；“p_num”为酪氨酸发生磷酸化的个数。

SamplePhos-ALL-Phos-proteinsPhos-ALL-“ALL-protens”为鉴定到的蛋白质的个数；“Phos-protens”为发生磷酸化的蛋白质个数；“Phos-protensRato”为磷LB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT40.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT401.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT402.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT5.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT51.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT53.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/ATCK.phosphoryated_pro.xLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/CK1.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/CK3.phosphoryated_pro.xs不同的磷酸化蛋白质异构体，这些都会进一步增加专一性位点分析的复杂性，具体实验流程如下图。图2-1蛋白质磷酸化鉴定分析的实验流程（1）从样品中提取蛋白；（2）对提取后的蛋白样品进行还原烷基化处理，打开Choematography，SCX）进行预分离；（8）进行液相串联质谱(qudchromatographycoupedwthtandemmass上清液在56摄氏度条件下加入终浓度10mMDTT处理1Bradford最终体积为20μ1是不含蛋白的参照，其他管分别含有0.4、0.8、1.2、1.6、2、2.4、2.8、3.2、3.6μg蛋白。65%CAN，0.5%TFA(pH2.-3.5)洗脱一次，65%ACN,0.1%TFA(pH2.-3.5)个组分上样10μ（约5μg蛋白），通过岛津公司LC-20AD型号的纳升液相色谱仪进行反相分离。所用的反相柱为C18柱，包括,,转化成数据；离子碎裂的能量设置为35±5eV；母离子动态排除设置为：在一半的出峰时间内（约18s），相同母离子的碎裂在分析磷酸化位点时，首先利用常用的基于数据库搜索的蛋白质软件识别样品中的蛋白质；之后根据质量控制得到可信肽段及蛋白质并进行功能分析；然后根据可变修饰的形式，筛选出磷酸化的肽段及蛋白质；最后进行磷酸化蛋白质的富集分析，试图找到其在生物体中发挥的作用。具体信息分析流程如下图。图2-2蛋白质磷酸化信息分析流程（1）利用常用的基于数据库搜索的蛋白质软件识别样品中的蛋白质；2）制得到可信肽段及蛋白质并进行功能分析；（3）根据可变修饰的形式，筛选出磷酸化的肽段及蛋白质；（4）进行磷酸化蛋白质富集分析，试图找到其在生物体中发挥的作用。TITLE=Spectrum1scans:115.55481116.11040136.94980173.90498180.86188190.94720目前使用到的数据库主要可以分为两类，一类是由NC负责维护的，另外一类是由负责维护的。数据库建立的方法主要有以下几种：NCBInr相关的大类蛋白质组数据库。链接地址：ftp://ftp.arab/home/tar/Protens/TAIR10_proten_MascotMascot是一个蛋白质鉴定软件，曾被Frost/Suvan研究机构评为生物质谱软件的黄金标准。该项目中使用的软件版本

VarabemodfcatGn->pyro-Gu(N-termQ),Oxdaton(M),Phospho(ST),PhosphoFxedmodfcatCarbamdomethyMaxMssedC2InstrumentDefauQuanttat图3-1LB10014-02_phosphoryaton_20121226/QC/AT401_pep_deta_mass_dstrbuton.pdfLB10014-02_phosphoryaton_20121226/QC/AT402_pep_deta_mass_dstrbuton.pdfLB10014-02_phosphoryaton_20121226/QC/AT51_pep_deta_mass_dstrbuton.pdfLB10014-02_phosphoryaton_20121226/QC/AT53_pep_deta_mass_dstrbuton.pdfLB10014-02_phosphoryaton_20121226/QC/CK1_pep_deta_mass_dstrbuton.pdfLB10014-02_phosphoryaton_20121226/QC/CK3_pep_deta_mass_dstrbuton.pdf在真核生物中，磷酸化主要发生于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等残基；而在细菌中，蛋白质主要通过天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸等残基被磷酸化；有些蛋白质在原核生物和真核生物中均可被磷酸化，它们的磷酸化位点通常是精氨酸、赖氨酸和半胱氨酸残基。人类蛋白质组中含有约10万多个潜在的磷酸化位点，大多数磷酸化蛋白含有一个以上的磷酸化位点，并且以不同磷酸化形式的混合物存在，在胞内活性调控中发挥着重要作用。数HPO3=80Da）；在经碎裂后，发生磷酸化的位点由于加上磷酸化基团HPO3，故这些位点的实际测量质量与理论值相差量质量与理论值相差98Da（H3PO4=98Da）。据此可推测发生磷酸化的位点。SamplePhospho-IdentifiedIdentifiedIdentified222“Phospho-stes”为识别的磷酸化位点的总数；“IdentfedPhospho_S”为识别的丝氨酸位点数；“IdentfedPhospho_T”为识别的苏氨酸位点数；“IdentfedPhospho_Y”为识别的酪氨酸位点数。LB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT40.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT401.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT402.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT5.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT51.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT53.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/ATCK.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/CK1.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/CK3.phosphoryated_pro.xsPhospho-90%-75%-50%-010100表注：“Phospho-se”90%100%、75%90%、50%75%、50%为鉴定到的位点实际发生磷酸化的可能性区间；第三列至第六列为每一个可能性区间相应的磷酸化位点数。Total000010表注：“oa_Num”为可能性大于75%的磷酸化位点的个数；“p_num“为丝氨酸发生磷酸化的个数；p_num发生磷酸化的个数；“p_num”为酪氨酸发生磷酸化的个数。图3-2LB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT401.pep_phos_ste_number_dstrbuton.pdfLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT402.pep_phos_ste_number_dstrbuton.pdfLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT51.pep_phos_ste_number_dstrbuton.pdfLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT53.pep_phos_ste_number_dstrbuton.pdfLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/CK1.pep_phos_ste_number_dstrbuton.pdfLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/CK3.pep_phos_ste_number_dstrbuton.pdfSampleIDPhos-proteinsALL-proteinsPhos-proteinsRatioPhos-peptidesALL-peptidesPhos-peptides“ALL-protens”为鉴定到的蛋白质的个数；“Phos-protens”为发生磷酸化的蛋白质个数；“Phos-protensRato”为磷“LB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT40.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT401.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT402.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT5.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT51.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT53.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/ATCK.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/CK1.phosphoryated_pro.xsLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/CK3.phosphoryated_pro.xs图3-3LB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT401.phos_pep_n_pro_dstrbuton.pdfLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT402.phos_pep_n_pro_dstrbuton.pdfLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT51.phos_pep_n_pro_dstrbuton.pdfLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/AT53.phos_pep_n_pro_dstrbuton.pdfLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/CK1.phos_pep_n_pro_dstrbuton.pdfLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_resut/CK3.phos_pep_n_pro_dstrbuton.pdfvocabuary）来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。GO总共有三个本体（ontoogy），分别描述基因的分子功能（moecuarfuncton）、所处的细胞位置（ceuarcomponent）、参与的生物过程（boogcaprocess）。详细信息见网站：http://www.geneontoproten2go：针对每个磷酸化蛋白，给出所有相应的GO功能的ID列表。go2proten：针对三个ontoogy（ceuarcomponent，boogcaprocess，moecuarfuncton）中所涉及的GOcass，图3-4GOLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_proten_annotaton/AT40_phos_GOLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_proten_annotaton/AT5_phos_GOLB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton_proten_annotaton/ATCK_phos_GOC（Cuserofrhoogousroupsofproens蛋白相邻类的聚簇）是对蛋白质进行直系同源分类的数据库。构成每个C的蛋白都是被假定为来自于一个祖先蛋白，因此或者是orhoogs或者是paraog。rhoogs是指来自于不同物种的由垂直家系（物种形成）进化而来的蛋白，并特异性地保留与原始蛋白相同的功能。araogs是那些在一定物种中的来源于基因复制的蛋白，可能会进化出新的与原来有关的功能。本流程将鉴定到的所有磷酸化蛋白质和C可能的功能并对其做功能分类统计。图3-5COGCOG分类条目，纵坐标为功能分类对应的蛋白数量。该图表示样品中不同功能的蛋白质的统计LB10014-02_phosphoryaton_20121226/Phosphoryaton