大鼠结直肠扩张诱导内脏痛敏模型的建立及rpv1表达的影响

大鼠结直肠扩张诱导内脏痛敏模型的建立及rpv1表达的影响

内脏疼痛是一种慢性疼痛，内脏疼痛是导致内脏疼痛的最重要机制。它是内脏疾病（如炎症性肠病）和功能肠病（如肠炎综合征）的常见疾病。近年发现,除炎性反应性肠病外,功能性肠病肠壁也有炎性反应存在,并发现这些肠病的腹痛和内脏痛敏与瞬时感受器电位香草酸受体亚型1(transientreceptorpotentialvanilloid1,TRPV1)的表达程度有关。TRPV1是存在于细胞膜或胞内细胞器膜上的非选择性阳离子通道蛋白,在人体中分布广泛,除神经系统表达外,在树突状细胞、肥大细胞、白细胞以及胃、结肠等均有表达,TRPV1的上调和敏感化可能与内脏痛敏成正相关。树突状细胞、肥大细胞、白细胞等炎性反应细胞和免疫细胞的前体细胞均来自于骨髓细胞,骨髓细胞TRPV1的表达变化是否与内脏痛敏有关值得探讨。热敏灸是指施灸热敏腧穴治疗时产生透热、扩热、传热、局部不热远部热等现象的一种悬灸治疗方法,一般施灸时间约40min,比其它灸法施灸时间长,疗效较好。通过热敏悬灸治疗腹泻型肠易激综合征取得较好效果,患者高发热敏穴区热敏腧穴的分布在天枢、命门出现率较高,其次是在大肠俞、足三里、关元穴区。本研究以新生乳鼠结直肠扩张(colorectaldistension,CRD)制备肠易激综合征内脏痛敏模型,悬灸成年后大鼠热敏腧穴“大肠俞”40min模拟热敏灸,观察镇痛效应与骨髓细胞TRPV1表达变化的关系,为进一步探索热敏灸的作用机制奠定基础。1材料和方法1.1大鼠内脏痛敏检测SD大鼠由南昌大学医学实验动物中心提供。交配后所产雄性新生SD大鼠8~10只与其哺乳母鼠共同饲养,自由饮食饮水,随机分为对照组、模型组。鼠龄8周时对照组存活37只,模型组存活41只,都进行内脏痛敏检测。随机将其中28只鼠均分为对照组、模型组、艾灸对照组、艾灸模型组。实验中对动物的处理符合相关动物使用伦理学原则。1.2试剂及仪器美国ABI7500实时荧光定量PCR仪,反转录试剂盒和荧光定量试剂盒SYBR?PremixExTaqTMⅡ(TaKaRa,大连宝生物工程有限公司),TrizolReagent购于Invitrogen公司,艾灸条由江西中医学院附属医院动物科学研究部提供。1.3大鼠球囊扩张参照文献球囊扩张刺激乳鼠直结肠制备肠易激综合征内脏痛敏模型方法。将出生8d的乳鼠,随机分为对照组与模型组。模型组在出生后第8~14天,用血管扩张球囊(直径2mm,长2cm)自大鼠肛门轻柔插入2~3cm,球囊充气扩张1min,维持压力60mmHg(1mmHg≈0.133kPa),30min后重复扩张刺激1min,每日1次,持续1周。对照组施予同样时间的会阴部抚摸。完成上述刺激后直到乳鼠成年(8周以上),大鼠不再接受任何刺激。1.4crd扩张和awr评价大鼠饲养8周后,对CRD诱发的腹部撤回反射(abdominalwithdrawalreflex,AWR)进行半定量评分。实验前,禁食不禁水12h,以减少粪便形成,并于实验前轻触肛门,使其排出残余粪便。乙醚麻醉SD大鼠,在大鼠麻醉状态下自肛门内置入自制的CRD扩张球囊,深度为6~8cm,并用胶带将球囊导管固定于大鼠尾部。置大鼠于特制的笼巢内,以限制其活动,待大鼠苏醒后30min,进行CRD刺激,缓慢增加压力至大鼠腹部刚出现抬起时的压力值作为痛阈值,并进行AWR评分。CRD分为20、40、60、80mmHg4个刺激等级。相应的AWR评分标准参照Al-chaer的方法,具体如下:对CRD刺激无行为反应,评为0分;给予刺激大鼠有动作,停顿后并见短暂的头部运动行为,评为1分;刺激期间,见有腹部肌肉的收缩,评为2分;如有腹部抬起行为,评为3分;身体拱起,并抬起盆腔和阴囊者,评为4分。扩张压力的监测通过1个三通管,连接扩张球囊和台式血压计而实现。每次CRD刺激持续20s,间隔5min后给下一次刺激;每个刺激强度重复3次,取平均值作为最后的评分值和痛阈值。1.5实时荧光定量pcr检测骨髓细胞“大肠俞”位于大鼠第4腰椎棘突旁开0.5cm。将艾灸各组大鼠置于特制大鼠固定器内限制活动,将艾条固定于自制艾灸支架上,艾灸穴位孔直径0.5cm,垂直距离大鼠单侧“大肠俞”穴区约2cm,点燃施灸40min模拟热敏灸,艾灸后进行AWR评分及痛阈值测定;非艾灸组大鼠同样置固定器内限制活动,在静置40min后进行AWR评分及痛阈值测定。大鼠脱臼处死,无菌条件下取股骨和胫骨,冲洗髓腔,冲洗液离心获取新鲜骨髓细胞,按照RNA提取试剂盒说明书用Trizol试剂抽提大鼠骨髓细胞总RNA。根据TaKaRa公司反转录试剂盒说明,以mRNA作为模板进行反转录,将总RNA反转录为cDNA,-20℃冰箱保存备用。产物cDNA应用荧光定量试剂盒PremixExTaqTMⅡ在ABI7500实时荧光定量PCR仪上进行TRPV1mRNA检测,以GAPDH为内参照。引物设计:TRPV1上游序列为5’-GACATGCCACCCAG-CAGG-3’,下游序列为5’-TCAATTCCCACA-CACCTCCC-3’,扩增片段大小为262bp;GAPDH上游序列为5’-CTCATGACCACAGTCCATGC-3’,下游序列为5’-TTCAGCTCTGGGATGAC-CTT-3’,扩增片段大小为155bp。PCR反应体系20μL,包括SYBRGreenⅠ10μL,ROXⅡ0.4μL,10mmol/L的上下游引物各0.4μL,cDNA模板0.4μL,补充灭菌ddH2O至20μL。RT-PCR反应条件:95℃预变性30s,95℃变性5s,60℃退火延伸34s,共40个循环。加样时,每一样本和基因同时做1个相同的复孔,输出数据为两者的平均值,用ABI7500实时荧光定量PCR仪配套软件RQStudy模块分析荧光数据,计算同一样本内目标基因与内参基因的相对表达量。1.7比较方法和样本选择数值用均数±标准差表示。应用SPSS12.0软件进行统计学处理,组内前后的比较选用配对t检验,两组间比较选择独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,进一步的两两比较用SNK检验,P<0.05为差异有统计学意义的标准。2结果2.1rt刺激痛阈值mmlpj,wt我们首先检测新生乳鼠直结肠球囊扩张刺激(模型组)在成年后是否有内脏痛敏。结果显示,模型组CRD刺激痛阈值[(31.77±10.64)mmHg]明显低于对照组痛阈值[(58.76±18.92)mmHg,P<0.01],模型组在20、40、60、80mmHg各级CRD的AWR评分均明显高于对照组(P<0.01),见图1。表明新生乳鼠CRD刺激可形成成年内脏痛敏。2.2艾日花旋转主要有20、40、60、80mmlph,p,p,p,p,p,p,p,p,p,p,p,p,p,p,.大鼠悬灸40min表现为舒适不动。模型组艾灸后痛阈值[(74.00±17.29)mmHg]明显高于艾灸前[(27.19±7.00)mmHg,P<0.01],艾灸后在20、40、60、80mmHg的CRD刺激AWR评分均明显低于艾灸前(P<0.01,P<0.05),见图2。表明模拟热敏灸对内脏痛敏大鼠有明显的镇痛效应。2.3艾日压力对aawr评分的影响在非伤害性CRD压力20mmHg刺激时,艾灸前与艾灸后AWR评分没有明显差异,但在伤害性CRD压力40、60、80mmHg刺激时,艾灸后AWR评分明显低于艾灸前(P<0.01),见图3。艾灸后痛阈值[(82.28±20.51)mmHg]也明显高于艾灸前痛阈值[(48.10±6.73)mmHg,P<0.05],表明艾灸正常动物“大肠俞”有增加内脏痛耐受性和镇痛作用。2.4两组抑制率在半数据文件crd时的比较镇痛效应以抑制率表示,抑制率=(艾灸前AWR评分值-艾灸后AWR评分值)/艾灸前AWR评分值×100%。结果显示,模型组抑制率在20mmHg的CRD时明显高于对照组(P<0.01),而在40、60、80mmHg的CRD时两组间差异没有统计学意义(P>0.05),见图4。表明在非伤害性CRD压力刺激时,模拟热敏灸可明显减轻模型组的内脏痛敏而不明显影响正常的基础感受反应,但在伤害性CRD压力刺激时,模拟热敏灸对内脏痛敏动物和正常动物的伤害性感受反应具有相同的抑制效应,均可发挥镇痛作用。2.5统计学方法大鼠在静置40min后其AWR评分在20、40、60、80mmHgCRD刺激时与静置前差异均无统计学意义(P>0.05),见图5。痛阈值在静置40min后[(43.18±23.40)mmHg]与静置前[(43.60±3.42)mmHg]差异也无统计学意义(P>0.05)。表明固定器内限制大鼠活动静置40min不影响CRD刺激反应,艾灸效应不是由于短时限制活动所造成的心理应激所致。2.6各组trpvm1rna表达比较对照组TRPV1mRNA相对表达量较低,对照组艾灸后TRPV1mRNA相对表达量略有降低(P>0.05),模型组TRPV1mRNA相对表达量明显高于对照组和艾灸对照组(P<0.01),艾灸模型组TRPV1mRNA相对表达量明显低于模型组(P<0.01),见图6。3热敏纺单次给药对内脏痛、痛敏和cri水平裂率的影响用新生期大鼠给予结直肠扩张刺激方法而建立的慢性内脏痛敏模型的表现与临床肠易激综合征相类似,AWR评分在一定程度上能够反映结直肠扩张所致的内脏伤害性刺激强度,可以作为判断慢性内脏痛敏模型是否成功的指标。艾灸在缓解和消除疼痛,尤其是内脏痛方面具有良好的疗效,艾灸疗法对肠易激综合征疗效确切;临床上热敏悬灸治疗腹泻型肠易激综合征取得较好效果,大肠俞是患者高发热敏穴区之一。由于动物实验一般艾灸时间在10~20min,而陈日新等研究表明在动物热敏穴区一般施灸时间约40min,并伴有尾部温度升高,疗效较好,因此动物实验中悬灸40min动物表现舒适不动的灸法可称为模拟热敏灸。我们观察到,在慢性内脏痛敏模型大鼠“大肠俞”单次模拟热敏灸时,灸后有明显的镇痛效应,而且对对照组大鼠“大肠俞”单次模拟热敏灸时,在伤害性CRD压力刺激时也有明显的镇痛效应,表明艾灸正常动物“大肠俞”对基础痛感受和痛反应也有影响,能增加内脏痛耐受性和产生镇痛作用。模拟热敏灸能产生镇痛作用的神经机制可能与“弥漫性伤害抑制性控制”(DNIC)有关,DNIC构成一个脊髓-脊髓上中枢-脊髓的神经回路,整合来自外周的伤害性信号,体表特定参数的热灸样刺激能够很好地抑制内脏伤害性反应,其作用机制很可能就是通过DNIC系统发挥痛的负反馈调节。内脏痛敏是引起内脏痛的最主要机制,外周病理信息长期存在是重要原因,如炎性反应性肠病时肠道上皮屏障被破坏,肠道免疫系统过度反应和错误识别,激活机体的免疫应答,炎性反应被逐级放大,最终导致组织损伤,出现病理改变和临床表现。肠易激综合征患者肠道有低度的炎性反应,肠道肥大细胞的数量及表达存在异常,肥大细胞脱颗粒释放的多种生物活性介质参与了肠易激综合征的病理生理过程。由此可见,内脏痛及痛敏的维持是需要外周炎性反应的持续或反复存在,炎性反应细胞和免疫细胞的前体细胞均来自于骨髓干细胞,骨髓干细胞包括造血干细胞(HSCs)和间充质干细胞(BMSCs),HSCs可以持续地分化成各种造血前体细胞,进而再分化成造血与免疫系统中的各类成熟的细胞。近来研究表明,感染、炎性反应时HSCs通过toll-like受体直接感受病原体,细胞因子干扰素和肿瘤坏死因子可通过血液循环到达造血微环境直接调节HSCs功能,前炎性反应细胞因子对维持基础水平的HSCs数量和功能是重要的,炎性反应对造血微环境的作用以及慢性炎性反应长时间如何影响HSCs值得研究。炎性反应除影响HSCs外,也可动员BMSCs进入血液循环。既然慢性炎性反应与骨髓干细胞有关,慢性痛也可能与骨髓干细胞有关。由于炎性反应和内脏痛敏都与TRPV1有关,肠易激综合征病人的腹痛程度与结肠TRPV1高表达有关,炎性反应性肠病腹痛病人和大鼠模型也有结肠TRPV1高表达,这些疾病TRPV1的高表达是否与骨髓有关值得探讨。我们的研究结果表明,新生期大鼠CRD刺激引起慢性内脏痛敏,除出现明显痛阈降低和伤害性运动反射评分