宝大蒜气生鳞茎快繁技术研究

宝大蒜气生鳞茎快繁技术研究

大蒜是百合科的一种杏仁科。在中国种植了2000多年，并在全国范围内种植。大蒜以鳞茎(地蒜)、蒜薹和幼株食用,还可以生产青蒜和蒜黄,是群众最喜爱的主要蔬菜之一。宝坻大蒜“六瓣红”是津沽名优特产之一,营养价值高,具有强力杀菌、防治癌症、排毒清肠、降低血糖和防治心脑血管疾病等功效。但是大蒜通常以蒜瓣进行无性繁殖,在长期的无性繁殖过程中,因病毒逐年积累并代代相传,使种性逐渐退化,蒜头变小,产量、品质大幅下降。大蒜采用气生鳞茎(天蒜)繁殖时,天蒜采自蒜薹(花薹)顶端的花苞(生长点),而大蒜生长点部位一般不带病毒,因而可自然脱毒。目前已建立了以茎尖、根尖、全展叶、贮藏叶、茎盘切块和花原始体等为外植体的大蒜组织培养再生体系。大蒜的离体再生途径主要有愈伤组织途径和不定芽途径。愈伤组织途径是通过外植体的脱分化实现的,但是愈伤组织再生途径的效率不高,因此建立一种新的高效的大蒜快繁体系是非常必要的。大蒜气生鳞茎在生产实践上主要被用来提纯及复壮,但由于只有成熟的气生鳞茎才能做“种子”,而培养成熟的气生鳞茎会争夺地蒜的营养,影响地蒜的产量,降低种蒜的收益。该研究利用未成熟的大蒜气生鳞茎作为外植体直接诱导试管苗,使大蒜实现天然脱毒的同时,又避免愈伤组织途径脱分化、再分化、繁殖系数低以及容易产生遗传变异的缺憾,同时不影响地蒜的正常生长,以期为宝坻大蒜的脱毒快繁和种质创新打下基础。1材料和方法1.1试验材料供试材料为宝坻大蒜“六瓣红”的气生鳞茎。1.2测试方法1.2.1气生嘴唇形态观察选取3个花苞,按体积的大小从中挑取10颗气生鳞茎进行排序,分别称量并记录气生鳞茎重量,并进行形态学解剖,观察其是否含有贮藏叶。统计重量为何值时气生鳞茎中不再含有贮藏叶。因为只有含有贮藏叶,气生鳞茎才有可能诱导生成试管苗。3次重复。1.2.2培养基的制备以MS培养基为基本培养基,添加不同种类和浓度的激素,pH5.8;高温高压灭菌20min;待冷却至60℃时,分装到200mL的组培瓶中,每瓶约35mL,盖紧瓶盖备用。试验中所用培养基为:试管苗诱导培养基:MS基础培养基+1.0mg/LNAA+5.0mg/LKT;试管苗生根培养基:MS基础培养基。1.2.3大蒜气生英镑的低温处理在不影响地蒜生长的前提下将尚未成熟的花苞采摘下来,4℃保存,共设置低温7、14、28、84d4个处理,用于试管苗诱导试验。1.2.4试苗诱导处理取生长良好有贮藏叶的宝坻大蒜气生鳞茎,用75%的乙醇浸泡10min,用无菌水冲洗,滤纸吸干,再用0.1%的HgCl2灭菌10min,用无菌水冲洗3次,滤纸吸干,接入试管苗诱导培养基上,每瓶接入7颗气生鳞茎,每个处理20瓶,按1.2.3下的方法低温处理。培养条件为日温25℃,夜温20℃,光照1500lx,光照时间14h/d。培养49d,每7d进行观察统计诱导率。1.2.5生根培养将诱导出来的生长旺盛的苗转入生根培养基中,诱导生根,生根培养基为MS基础培养基。35d之后统计生根率。1.2.6壮苗和小植株的移栽和栽植生根后的试管苗,待其长到3片真叶、生根3~4条时,室温开瓶练苗,7~10d后将小植株从试管中取出,洗去根部培养基将其移栽至灭菌的珍珠岩、蛭石和泥炭土(1∶3∶6)中,移栽后保持日温25℃,夜温15℃,在组织培养室中放置30d壮苗,之后移栽到大田。1.2.7卡诺固定液待地蒜根(对照)和气生鳞茎诱导的试管苗的根长到1cm时将根取下,用卡诺固定液固定24h,于70%乙醇中保存,用于染色体观察。将根在1mol/L盐酸、60℃条件下解离8min,蒸馏水冲洗3遍,用滤纸将处理好的根擦干,取根尖,用卡宝品红染色8min,压片,进行染色体的观察。2结果与分析2.1气生茎重量对作酒精度的预测气生鳞茎是否含有贮藏叶是其能否发芽的关键,只有含有贮藏叶的气生鳞茎才有可能被诱导生成试管苗,所以,在气生鳞茎诱导培养之前,对不同大小的气生鳞茎做形态学解剖,找出气生鳞茎的重量与是否含有贮藏叶之间的关联,最终通过称重挑选带有贮藏叶的气生鳞茎进行试管苗诱导。从表1可以看出,在第1组中重量为0.0093g的气生鳞茎含有贮藏叶,重量为0.0076g的气生鳞茎不含有贮藏叶,第2组中重量为0.0089g的含有贮藏叶,重量为0.0078g的不含有贮藏叶,在第3组中重量为0.0088g的含有贮藏叶,重量为0.0082g不含有贮藏叶。3次试验中不含贮藏叶的气生鳞茎重量的平均值为0.009g,所以,选取重量大于0.009g的气生鳞茎用于试管苗的诱导,弃掉重量小于0.009g的气生鳞茎。2.2低温处理对气生培养后培养率的影响从表2可以看出,低温处理7、14、28、84d的气生鳞茎,培养7d后,前3种处理的气生鳞茎诱导率基本相近,分别为2.09%、2.16%、2.12%,而低温处理84d的气生鳞茎,培养7d后诱导率为0,到21d时才达到2.24%,此时低温处理14d的气生鳞茎诱导率已经达到47.47%;培养到第70天时,试管苗的诱导率分别为68.61%、81.66%、34.24%、38.65%,显然低温处理14d的气生鳞茎萌发率和试管苗的诱导率都高于其它低温处理组。2.3气生嘴唇诱导生成苗由图1可以看出,在接入诱导培养基7d后,气生鳞茎的表面开始变绿(图B);生长14d后,部分气生鳞茎的内部开始长出嫩芽(图C);21d后,气生鳞茎诱导生成的苗逐渐长大,数量开始增多,诱导率逐渐增大(图D);生长28d后,气生鳞茎诱导出的苗不断生长,出苗率不断增加;发育至49d时,苗已长至10cm左右,生长强壮、呈深绿色(图E-H)。每个宝坻大蒜的花苞平均含有70颗气生鳞茎,其中65颗含有贮藏叶,可用于试管苗的诱导,一个花苞平均可以获得试管苗40株(繁殖系数为40),与用地蒜繁殖大蒜(繁殖系数为6)相比,效率提高了6.67倍。2.4数的试苗的生根有9%的气生鳞茎试管苗在诱导培养基上出现生根现象,但绝大多数的试管苗没有生根。将未生根的试管苗接种在生根培养基上(MS基础培养基),6d后,部分试管苗出现生根现象,继续培养到45d时,试管苗的生根率达到95%以上(图2)。2.5提高组培苗的培养、栽培苗的种植和使用的能力为了提高试管苗对外界环境条件的适应性,提高其光合作用的能力,促使组培苗健壮,移栽成活率高,试管苗必需经过一段时间的练苗后方可移栽。该研究共移栽试管苗330株,成活330株,成活率为100%。2.6细胞分裂期图从图3可以看出,A为大蒜根尖细胞分裂前期图,B为细胞分裂中期图,能清晰的看出细胞中含有16条染色体。C为细胞分裂后期图。D为气生鳞茎试管苗根尖细胞分裂前期图,B为细胞分裂中期图,能清晰的看出细胞中含有16条染色体。F为细胞分裂后期图。上述结果说明,用气生鳞茎直接诱导的试管苗细胞染色体数目、形态结构正常,诱导过程中没有发生染色体变异,进一步说明不经过脱分化和再分化过程,对保持大蒜品种的遗传特性有现实意义。3大蒜气生茎的提取与贮藏技术用大蒜愈伤组织进行脱毒和快繁虽然有诸多优点,但大蒜愈伤组织在脱分化和再分化过程中普遍存在着染色体的高变异率,Maggioni等用叶片外植体诱导的愈伤组织,只有45.9%的细胞是二倍体,其它为八倍体、三倍体、四倍体、非整倍体,还有20%的细胞含很多染色体。为了保持大蒜的遗传特性,同时又能进行大蒜的脱毒、快繁,生产上常常用成熟的气生鳞茎做“种子”进行大蒜提纯、复壮繁殖。张绍文等对大蒜气生鳞茎利用价值进行研究,发现用成熟的天蒜播种,其增殖倍数均在30倍以上,但留天蒜植株的地蒜产量较不留株减产22.6%~33.0%。该研究建立了用未成熟的气生鳞茎进行大蒜脱毒快繁的技术体系,在不影响地蒜生长的情况下实现了大蒜快繁。大蒜气生鳞茎的萌发受到贮藏时间、温度、气生鳞茎大小、植物激素配比等多种因素的影响。低温处理时间对气生鳞茎试管苗的诱导率有一定的影响,李小川等、Seabrook认为气生鳞茎在4℃的低温条件下贮藏一定的时间能够打